PTG重组腺病毒过表达载体的构建

目的 构建及鉴定携带小鼠PTG基因(NM＿016854)的过表达重组腺病毒载体，为深入研究PTG的功能奠定基础。方法 化学合成小鼠PTG基因的编码序列，经聚合酶链式反应(PCR)扩增、酶切，后插入GV314载体(CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP),得到重组穿梭质粒pGV314-PTG;进一步BamHⅠ/AgeⅠ双酶切，产物交换入线性化表达载体pDC315,构建重组腺病毒Ad-PTG,将其转染HEK293T细胞包装成重组病毒颗粒，经在HEK293T细胞反复扩增数代后，进行纯化及滴度检测，最后利用PCR、Western blot及测序验证重组腺病毒。结果 经PCR、Western blot及测序后，结果显示成功构建pGV314-CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-PTG过表达腺病毒载体(Ad-PTG),终点稀释法测得病毒滴度为4×10¹⁰ PFU/ml, Western blot和荧光定量PCR显示PTG的蛋白和mRNA表达水平显著升高。结论 成功构建携带小鼠PTG基因的重组过表达腺病毒载体，且能有效上调肝细胞中PTG基因的表达。