人G6PD在大肠埃希菌中的表达及体外抑制剂筛选模型的建立

目的 表达人6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)并建立其体外抑制剂筛选模型。方法 设计一对5′端分别带NdeⅠ、XhoⅠ位点的引物，PCR扩增G6PD cDNA。将cDNA和质粒pET-28a经NdeⅠ+XhoⅠ酶切后连接，连接产物转化大肠杆菌Top10。将鉴定的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用0.4 mmol/L IPTG诱导G6PD表达，镍离子亲和层析柱纯化G6PD。以6-磷酸葡萄糖(G6P)和烟酰胺腺嘌呤核苷二磷酸(NADP+)为G6PD的底物和辅因子，检测340 nm波长处光吸收值(A₃₄₀)的变化，确定G6PD及其抑制剂脱氢表雄酮(DHEA)的最佳浓度，计算模型的可靠性指数—Z′因子。结果 构建了重组质粒pET-28a-G6PD,重组菌BL21(DE3)-pET-28a-G6PD经IPTG诱导后，可溶性G6PD表达量为2.5 mg/L,G6PD、DHEA的最适浓度分别为900μg/L、20μmol/L,筛选模型的Z′因子为0.88。结论 在大肠杆菌中表达了有活性的G6PD,建立了可靠的体外抑制剂筛选模型。