胰腺十二指肠同源框蛋白1基因转染人骨髓间充质干细胞及向胰岛样细胞的分化

背景：随着人胰岛素基因及某些血糖调节酶基因的克隆，以及重组载体为基础的基因克隆技术的建立，使骨髓间充质干细胞更容易向胰岛素分泌细胞分化，且具有体外扩增明显而无致瘤性的优点。目的：利用胰腺十二指肠同源框蛋白1(pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1)基因转染人骨髓间充质干细胞，观察基因修饰向胰岛样细胞的分化情况。设计、时间及地点：细胞-基因学体外实验，于2008-01/07在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。材料：骨髓来源于糖尿病患者，由青岛大学医学院附属医院干细胞中心提供。方法：利用反转录聚合酶链技术构建PDX-1基因的cDNA，酶切后插入经相同酶切处理的含绿色荧光蛋白的空白载体PEGFP-N1，构成重组质粒，再进行Bgl Ⅱ、HindⅢ双酶切筛选、鉴定并测序。Percoll法分离培养人骨髓间充质干细胞，当细胞汇合至90%时胰蛋白酶消化传代。转染前1 d加入无抗生素培养基，将第3代细胞按5×105接种于6孔培养板，适量重组载体及脂质体溶解后混合形成DNA-脂质体混合物，培养5 h后更换普通培养液。同时设立对照组，在6孔板中进行空白质粒转染。主要观察指标：脂质体介导转染后，荧光显微镜观察细胞转染情况；免疫荧光染色检测PDX-1蛋白的表达；双硫腙染色鉴定细胞分化情况。结果：通过测序、凝胶电泳、酶切等确定PDX-1基因已正确插入重组质粒。荧光显微镜下，成功转染的骨髓间充质干细胞发出绿色荧光，质粒转染效率约70%。转染8 d的细胞PDX-1呈阳性表达，对照组细胞PDX-1呈阴性。转染后14 d可见半悬浮的胰岛样细胞团，双硫腙染色呈棕红色，而未转染的对照组细胞双硫腙染色不着色。结论：PDX-1基因重组载体能够导入人骨髓间充质干细胞且稳定表达，并可以转化为胰岛样细胞。

Pancreatic duodenal homeobox-1 gene transfected human bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into islet-like cells