人铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化 |
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引用本文: | 刘磊,许淑芬,方艳秋,谭岩.人铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化[J].老年学杂志,2008,28(5):434-436. |
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作者姓名: | 刘磊 许淑芬 方艳秋 谭岩 |
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作者单位: | 吉林大学第一医院中心实验室,吉林长春130021 |
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摘 要: | 目的构建人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,Zn-SOD)原核表达载体并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白,为其临床应用奠定基础。方法根据已报道的hCu,Zn-SOD基因序列,采用RT-PCR技术从外周血单个核细胞(PBMC)中获得SOD cDNA序列。将所得的PCR产物插入克隆载体pGEM-Teasy中,重组质粒经酶切,PCR及测序鉴定正确后,将目的片段插入原核表达载体PET20b(+)中并转化大肠杆菌DE3,通过IPTG诱导表达出目的蛋白,经镍固定金属亲和层析纯化。采用邻苯三酚自身氧化法测定SOD生物学活性。结果序列分析表明SOD基因成熟肽编码区含有465bp与GenBank(X02317)中已报道序列一致的SOD核苷酸。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示表达的目的蛋白分子质量约为19kD并与商品化的人SOD单抗呈特异性反应。经Ni^2+-NTA琼脂糖纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。可溶蛋白酶活力达1300U/ml。结论在大肠杆菌中获得了人SOD的高效表达,为研究其生物学功能和广泛应用奠定了基础。
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关 键 词: | 人超氧化物歧化酶 表达纯化 大肠杆菌 |
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