烟曲霉对小鼠巨噬细胞自噬流的影响初步研究

【摘要】 目的 探讨烟曲霉对小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）自噬流的影响。方法 灭活烟曲霉体外诱导小鼠BMDM不同时间（0、0.5、4、12 h），提取细胞蛋白，Western印迹法检测自噬关键蛋白LC3-Ⅰ型/Ⅱ型的转换及磷酸化雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）Ser2481的蛋白水平。用烟曲霉和溶酶体阻断剂［包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64d + 胃蛋白酶抑制剂pepstatin、巴佛洛霉素-A1（BAF-A1）、氯化铵、氯喹］单独或联合体外诱导小鼠BMDM不同时间（4、12 h）后，Western印迹法检测烟曲霉对新生的LC3-Ⅱ、细胞基础自噬流的影响，并通过共聚焦荧光显微镜观察烟曲霉与LC3、Rubicon（RUN domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich-domain-containing protein）的共定位关系。不同处理时间数据结果采用非匹配t检验分析，烟曲霉孢子和自噬溶酶体阻断剂两因素处理数据结果采用2 × 2析因分析方法。结果 Western印迹显示，与对照组（0 h组）比较，烟曲霉体外诱导小鼠BMDM 0.5、4、12 h后细胞内LC3-Ⅱ表达逐渐增加，差异均有统计学意义（t值分别为6.58、3.28、3.02，均P < 0.05），但各组p-mTOR蛋白水平差异无统计学意义（t值分别为0.441、0.477、0.382，P值分别为0.682、0.660、0.722）。与单独氯喹处理BMDM 4 h和12 h相比，烟曲霉联合氯喹处理后 LC3-Ⅱ进一步增高，差异均有统计学意义（t = 2.13、2.78，均P < 0.05）。与单独氯化铵处理BMDM 4 h和12 h相比，烟曲霉联合氯化铵处理后 LC3-Ⅱ进一步增高，差异均有统计学意义（t = 2.92、2.92，均P < 0.05）。与单独BAF-A1处理BMDM 4 h和12 h相比，烟曲霉联合BAF-A1处理后LC3-Ⅱ进一步增高，差异有统计学意义（t = 2.13、2.13，均P < 0.05）。与单独E-64d + pepstatin处理BMDM 4 h和12 h相比，烟曲霉联合E-64d + pepstatin处理后 LC3-Ⅱ进一步增高，差异有统计学意义（t = 2.13、2.92，均P < 0.05）。用钙荧光白荧光标记的烟曲霉孢子刺激BMDM 8 h后，共聚焦荧光显微镜显示LC3、Rubicon主要包绕于烟曲霉周围，与烟曲霉均有共定位关系。结论 烟曲霉体外诱导可增加小鼠BMDM基础自噬流。