大鼠Akt1基因真核表达载体构建及其在293细胞中的表达

背景: Akt在细胞存活、细胞增殖、细胞代谢和细胞凋亡等活动中扮演着重要角色。虽然Akt的作用机制目前尚有很多的未知领域，但其作为生存信号的一个重要组件，已成为近年分子生物研究中的一个重要课题。 目的：构建Akt1基因真核表达载体 pDC316-Akt1，观察其在293细胞(人胚肾母细胞)中的表达。 设计、时间及地点：观察性实验，于2006-09/12在解放军军事医学科学院分子生物实验室完成。 材料：pDC316质粒，由本元正阳公司提供；DH5α、293细胞为自备。 方法：采用反转录-聚合酶链反应方法自大鼠肝组织总RNA中克隆Akt1DNA片段，测序鉴定正确后，插入真核表达载体pDC316的EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位点，构建Akt1真核表达载体 Akt-pDC316，脂质体介导法转染293细胞。 主要观察指标：蛋白免疫印迹检测转染293细胞中Akt1的表达。 结果：经测序鉴定，构建的Akt1氨基酸序列与野生型Akt1序列完全相符。将Akt-pDC316转入293细胞，蛋白免疫印迹检测可见相对分子质量55 000位置有Akt1的表达。 结论：构建Akt1基因真核表达载体在293细胞中可以充分的表达。