| 大鼠神经母细胞特异性转移因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 |
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| 作者姓名： | 袁 静 葛 坚 俞建雄 |
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| 作者单位： | 武汉大学人民医院，眼科中心，普外科，湖北省武汉市 430060；中山大学中山眼科中心，眼科学国家重点实验室，广东省广州市 510060 |
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| 基金项目： | 中山大学中山眼科中心眼科学国家重点室开放课题(303060202400306)“ASCL1信号在诱导神经干细胞向视神经细胞定向分化中的作用及机制”；国家自然科学基金青年基金(81100664)“17β-E2调控BMSCs向神经细胞分化及在青光眼视神经再生中的作用和机制”；武汉市青年科技晨光计划项目(2014070404010222) “miR-124调控诱导神经干细胞向视神经细胞定向分化和在青光眼视神经再生中的作用及机制”；武汉大学自主科研项目学科交叉类(2042014kf0259)“复合TFPI-2多肽凝胶药物控释系统在青光眼小梁切除手术中的应用及作用机制研究” |
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| 摘 要： | 背景：研究表明，神经母细胞特异性转移因子(ASCL1)是神经发育过程中的关键调控因子，因此通过对成体细胞进行ASCL1基因修饰，有可能将成体细胞转分化为神经细胞，为视神经再生治疗提供新策略。
目的：构建携带鼠ASCL1基因的重组腺病毒表达载体，获得重组腺病毒pAd-rat-ASCL1-EGFP，以期为进一步研究ASCL1基因的功能奠定基础。
方法：用XhoⅠ和 EcoRⅠ将目的基因 ASCL1及带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭载体 pYr-adshuttle-4进行双酶切；回收酶切质粒的目的片段进行连接，产物转化至 DH5α感受态；提取质粒酶切鉴定正确后测序。然后通过LR体外同源重组将rat-ASCL1表达框构建至pAd/PL-DEST腺病毒表达载体，PacⅠ酶切线性化后用脂质体法转染HEK293细胞进行包装、扩增，采用PCR法对重组腺病毒进行鉴定，TCID50法测定病毒滴度，荧光显微镜观察病毒感染效率。
结果与结论：通过酶切鉴定和DNA测序鉴定，证实重组腺病毒载体pAd-rat-ASCL1-EGFP构建正确，PCR鉴定扩增出862 bp的目的条带，TCID50法测定病毒滴度为2×1010 pfu/mL。荧光显微镜观察HEK293细胞的病毒感染效率为80%以上。提示含ASCL1基因的重组腺病毒载体构建成功，获得的病毒具有高滴度，高效感染率，为下一步进行ASCL1基因功能研究和视神经再生治疗研究奠定了基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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| 关 键 词： | 干细胞 培养 神经母细胞特异性转移因子 重组腺病毒载体 增强型绿色荧光蛋白 病毒滴度 视神经再生 国家自然科学基金 |
Construction and identification of a recombinant adenovirus vector expressing rat achaete-scute homology 1 |
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| Authors: | Yuan Jing Ge Jian Yu Jian-xiong |
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| Institution: | Eye Center, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China; State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510060, Guangdong Province, China; Department of Gastrointestinal Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Stem Cells Adenoviridae Green Fluorescent Proteins Optic Nerve Tissue Engineering |
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