大鼠核因子-KB反义RNA腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达 |
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引用本文: | 胡榕,吴可贵,许昌声.大鼠核因子-KB反义RNA腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达[J].中国临床药理学与治疗学,2005,10(4):391-396. |
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作者姓名: | 胡榕 吴可贵 许昌声 |
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作者单位: | 福建医科大学附属协和医院心内科,福建福建省高血压研究所,福建福建省高血压研究所 福州350001福建福建省高血压研究所,福州350005,福建,福州350005,福建,福州350005,福建 |
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摘 要: | 目的:构建表达大鼠核因子κB(NF- κB ,p6 5 )反义RNA的重组腺病毒,并测定受染血管平滑肌细胞(VSMCs)中NF -κB基因的表达变化。方法:从自发性高血压大鼠(spontaneouslyhypertensiverat,SHR)的VSMCs中提取总RNA ,经RT PCR方法获得含全部编码序列的NF κB (p6 5 )cDNA片段(16 5 3bp) ,用TA克隆技术插入pMD18 T载体,构建pMD18 T/16 5 3重组质粒,并经酶切和DNA测序鉴定。以该质粒为模板,经PCR获得NF κB(p6 5 ) 3’端2 6 9bp片段,逆向插入pcDNA3.1( )真核表达载体并置于CMV启动子下。由此构建的pcDNA3.1( ) /2 6 9质粒含有NF κB(p6 5 )的2 6 9bp反义RNA完整表达框。随后将该表达框克隆到入门载体pENTR4 ,构建重组质粒pENTR4 /CMV/2 6 9。使用同源重组方式在体外将该表达框重组到腺病毒载体pAd/PL DEST ,最终得到重组腺病毒质粒pAd/CMV/2 6 9。线性化的重组腺病毒质粒转染2 93细胞后产生的重组腺病毒颗粒用于VSMCs的感染。WesternBlot测定感染前后VSMCs中NF- κB(p6 5 )表达的变化情况。结果:构建的pMD18 T/16 5 3重组质粒经过序列测定,证实其包含大鼠NF κB(p6 5 )基因的16 5 3bp片断;pcDNA3.1( ) /2 6 9、pENTR4 /CMV/2 6 9、pAd/CMV/2 6 9等重组质粒经内切酶消化或PCR等方法鉴定无误;线性化的pAd/CMV
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关 键 词: | 核因子-KB 反义RNA 腺病毒载体 表达调 控 蛋白免疫印迹 大鼠 |
文章编号: | 1009-2501(2005)04-0391-06 |
修稿时间: | 2005年2月15日 |
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