脐血、外周血内皮祖细胞分化成内皮细胞的实验研究

目的探讨人的脐血、外周血内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,并检测其表型和功能。方法新鲜脐血和健康成年人的外周血,使用Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,在M199培养基中体外培养,3d后去除悬浮细胞,继续培养,诱导EPCs增殖和分化。流式细胞仪检测EPCs标志CD34和内皮细胞特异性标志CD31表型,RTPCR检测ecNOS,flk1/KDR基因水平表达,免疫组化验证蛋白水平表达,并进一步通过NO活性的变化检测内皮细胞的功能。结果流式细胞仪检测,外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）刚分离时,CD34阳性表达率为（1.1±0.8）%,培养3d后为（16.9±6.2）%。细胞形态观察发现,刚分离的单个核细胞呈圆形,形态小,3d后有明显集落形成,7d后梭形细胞线样排列,随培养时间增加,细胞形态逐渐变大,呈现出典型铺路石样改变。脐血单个核细胞（umbilicalcordbloodmononuclearcells,CBMC）和PBMC培养10d后,CD31阳性表达率分别为（76±17）%和（82±9）%。RTPCR检测有内皮细胞特异性成分ecNOS,flk1/KDR的表达。免疫组化染色,细胞膜和细胞浆中有弥漫性棕色出现,呈阳性反应,证实了蛋白水平的表达。培养10d的贴壁细胞随着VEGF浓度增加,NO生成增加,具有内皮细胞的功能。结论脐血,外周血EPCs体外分离,纯化,诱导培养后的贴壁细胞表型检测,大部分细胞具有内皮系标志物,并具有产生NO功能。

Inducing cord blood and peripheral blood derived EPCs into endothelial cells in vitro