慢性乙肝患者HBV反转录酶区新变异rtL180M+A181C+M204V的鉴定及表型耐药特点分析

目的鉴定经核苷(酸)类似物序贯治疗的慢性乙肝患者HBV反转录酶(RT)区的新变异rtA181C,并分析其表型耐药特点。方法 2010年6月解放军302医院确诊的慢性乙肝患者1例,提取血清HBV DNA,巢式PCR扩增HBVRT全基因,采用PCR产物直接双向测序结合克隆测序分析HBV RT区12个耐药相关突变位点。构建代表性克隆重组表达载体pTriEx-HBV1.1,瞬时转染人肝癌细胞系HepG2细胞,转染4h后加入不同浓度拉米夫定(LAM,终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)、阿德福韦(ADV,终浓度为0、0.033、0.1、0.33、1、3.3μmol/L)、恩替卡韦(ETV,终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L)和替诺福韦(TDF,终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L),4d后采用实时荧光定量PCR检测不同药物浓度作用下培养细胞上清中HBV DNA的复制水平并分析其表型耐药特点。结果此例慢性乙肝患者序贯接受LAM治疗36个月→ADV治疗14个月→ETV治疗29个月,而后发生病毒学突破,HBV DNA由阴性升高至1.1×106IU/ml,ALT由正常升高至235U/L。直接测序显示HBV RT基因rtL180M+A181V+M204V变异,克隆测序得到18个克隆,其中9个为rtL180M+A181V+M204V变异株,7个为rtL180M+A181C+M204V变异株,1个为rtV173L+L180M+A181V变异株,1个为野生株。病毒复制力检测结果从高到低依次为:野生株>rtV173L+L180M+A181V>rtL180M+A181C+M204V>rtL180M+A181V+M204V。表型耐药分析显示,与野生株比较,rtL180M+A181V+M204V变异株和rtV173L+L180M+A181V变异株对LAM和ADV不敏感,rtL180M+A181C+M204V变异株对LAM和ETV不敏感。结论长期核苷(酸)类似物序贯治疗可引起多重耐药;rt181位点新的变异rtA181C与ETV长期用药有关,可能是新的ETV耐药变异位点。