人脑胶质瘤干细胞增殖和分化过程中NOTCH-1信号通路的调控

背景:研究发现NOTCH-1信号通路在神经干细胞或种经前体细胞的自我更新、增殖及分化中起重要作用.目的:探讨NOTCH-1信号通路在人脑胶质瘤干细胞增殖和分化过程中的调控作用.设计、时间及地点:开放性实验,于2005-01/2007 03在解放军第三军医大学新桥医院完成.材料:人脑胶质瘤组织、正常成人脑组织由解放军第三军医大学新桥医院神经外科提供.U251胶质瘤细胞株由解放军第三军医大学新桥医院神经外科吕胜青副教授惠赠:CHG-5胶质瘤细胞株由解放军第三军医大学西南医院病理研究所卞修武教授、姚晓红博士惠赠.方法:取人脑胶质瘤组织、正常成人脑组织、U251及CHG-5胶质瘤细胞株,采用免疫磁珠法分选获得CD133+脑胶质瘤干细胞,加入DMEM/F12无血清培养基进行增殖培养,形成细胞克隆后,加入含体积分数为10%胎牛血清的培养液,2 h后行抗CD133和抗巢蛋白免疫荧光双标染色.主要观察指标:人脑胶质瘤十细胞的生长和鉴定,采用WST-8法、免疫组化实验、流式细胞仪、免疫荧光双标实验检测NOTCH-1信号通路蛋白的表达.结果:在无血清培养基中,细胞呈悬浮生长,培养24～48 h可见单个细胞开始分裂生长,形成肿瘤球,将肿瘤球转入含胎牛血清的培养基后,4 h周边细胞伸出突起并逐渐分化,24 h后肿瘤球迁移出的细胞增多,形成单细胞层.肿瘤球能同时表达干细胞标志物CDl33和巢蛋白,CD133脑胶质瘤干细胞核浆比例达2/3～3/4,突起少,胞浆中线粒体等细胞器较少,核糖体丰富,未见胶质丝等分化结构,符合干细胞超微结构特点.NOTCH-1蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达明显强于正常成人脑组织(P＜0.01),在CDl33+U251及CHG-5胶质瘤细胞中有很强的表达,在GFAP+和MAP2+U251及CHG+5胶质瘤细胞中的表达强弱不等,在MBP+U251及CHG-5胶质瘤细胞中早弱表达或不表达.在脑胶质瘤干细胞增殖过程中能检测到较强的NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1,CBF-1,HES-1 mRNA及NO和TChH-1,HES-1蛋白表达;而在细胞分化时NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1,CBF-1,HES-1 mRNA和HES-1蛋白表达逐渐减弱.结论:NOTCH-1信号通路的关键蛋白分子NOTCH-1在人脑胶质瘤组织和胶质瘤细胞株中均有表达,而在正常成人脑组织中仅微弱表达.NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1和HES-1的表达强弱可能参与了胶质瘤干细胞增殖和分化的调控.

Regulatory effects of NOTCH-1 signaling pathway on the proliferation and differentiation of human brain glioma stem cells