原核表达活性内源性血管生成抑制剂canstatin蛋白

目的构建canstatin原核表达载体，表达重组人canstatin蛋白，并验证其生物学活性。方法利用BarnHⅠ和HindⅢ从重组质粒pUCm-T／canstatin上切下canstatin基因，插入表达质粒pET-22b（＋）相应位点，转化E.coli BL21。异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达，SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况。超声破碎菌体，NiNTA柱亲和层析纯化重组蛋白。PBS对其透析复性。鸡胚尿囊膜（CAM）实验验证目的蛋白抗血管生成活性。结果重组质粒pUCm-T／canstatin在BamHⅠ和HindⅢ双酶切后。电泳证实切下目的基因canstatin cDNA，将其插入质粒pET-22b（＋）相应位点，转化Ecoli BL21后。琼脂板上生长出多个白色菌落。挑选7个白色菌落做BamHⅠ和HindⅢ双酶切，所有菌落均切出分别对应原质粒与目的基因的2条特异性条带。证实均为阳性克隆。IPTG诱导其中1个克隆表达蛋白。SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量24000左右出现新的蛋白表达条带，诱导后1、2、3、4h表达蛋白占菌体总蛋白百分比分别为18．2％、18．8％、23．0％和23．4％。Ni—NTA柱亲和层析后，在125、250mmol／L洗脱液中纯化出目的蛋白。CAM实验显示重组人canstatin蛋白能抑制新生血管形成，且与剂量呈正相关。结论成功构建了canstatin原核表达载体，表达并纯化出有活性的重组人canstatin蛋白。为进一步研究其临床应用打下基础。

Prokaryotic expression of an active endogenous inhibitor of angiogenesis-canstatin