人canstatin基因克隆及其重组蛋白的表达和纯化

目的 克隆人血管能抑素canstatin基因，构建其原核表达载体，表达并纯化出canstatin蛋白。方法 从人胎盘组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增出canstatin基因，克隆进质粒pUCm-T，将测序正确的目的基因片段插入质粒pET-22b( )相应位点，转化E.coli BL21，IPTG诱导蛋白表达。超声破碎菌体，Ni-NTA柱亲和层析纯化重组蛋白。结果 从人胎盘组织中提取总RNA，显示3条清晰条带，分别对应28S，18S，5S，分光光度计法测得总RNA浓度为1．8g／L；RT-PCR扩增出与预期目的基因canstatin长度一致的cDNA片段；构建出克隆质粒pUCm-T／canstatin，基因测序结果与GenBank公布的canstatin基因序列完全一致；构建出表达质粒pET-22b( )／canstatin，BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实构建正确；IPTG诱导蛋白表达，SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量24kD左右出现新的蛋白表达条带，诱导后1h、2h、3h、4h表达蛋白占菌体总蛋白的百分比分别为18．2％、18．8％、23．0％和23．4％；诱导3h的菌体超声破碎后，Ni柱亲和层析，125、250mmol／L眯唑洗脱液SDS-PAGE电泳显示出清晰的单一条带。结论 成功克隆出canstatin基因，成功构建了其原核表达载体，并且成功表达、纯化出canstatin蛋白，为进一步研究其临床应用打下基础。

Cloning of human canstatin gene, expression and purification of its recombinant protein