| RhoC—miRNA真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 |
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| 引用本文： | 潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱筱娟.RhoC—miRNA真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达[J].中国老年学杂志,2009,29(3). |
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| 作者姓名： | 潘颖 毛丽君 孙艳霞 任淑萍 施恒亮 朱筱娟 |
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| 作者单位： | 1. 吉林大学第三临床医院妇产科,吉林,长春,130033
2. 东北师范大学遗传与细胞研究所 |
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| 基金项目： | 吉林省科技厅资助项目 |
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| 摘 要： | 目的 体外合成RNA干涉小分子构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-RhoC-miRNA真核表达载体,分析其在人卵巢癌细胞SKOV3中稳定表达情况.方法 设计并合成单链oligo,经退火形成双链的DNA oligo,将其与线性的pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒连接,构建重组质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-RhoC-miRNA真核表达载体,经扩增、筛选、鉴定及测序后,用脂质体法将重组质粒转染SKOV3细胞,筛选稳定转染细胞系、观察转染细胞的形态并进一步通过Western印迹法检测细胞内RhoC蛋白表达.结果 重组质粒进行PCR鉴定及DNA序列测定证实DNA oligo已被成功连接到载体中并且序列完全正确;经重组质粒转染的SKOV3细胞24 h后的荧光显微镜下观察到少量细胞带有绿色荧光信号,RhoC-miRNA稳定转染的SKOV3细胞形态变圆,折光性增强,收缩不铺展.Western印迹结果显示,与SKOV3细胞株及pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-neg细胞相比,pcDNATM6.2-GW/EmGFP-RhoC-miRNA细胞中RhoC蛋白表达水平明显降低,表明所设计的RhoC-miRNA能有效抑制SKOV3细胞中内RhoC蛋白表达.结论 该实验成功构建了RhoC-miRNA真核表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-RhoC-miRNA,利用脂质体法将其转染卵巢癌细胞后,能有效地抑制细胞内RhoC蛋白表达,为进一步研究RhoC的功能及探讨以RhoC为靶点的基因治疗提供了研究平台.
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| 关 键 词： | 卵巢肿瘤 RhoC蛋白 小分子干扰RNA(RNAi) 真核表达载体 |
Construction of RhoC-miRNA eukaryotic expression vector and its stable expression in ovarian carcinoma cell |
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