含hTERT启动子和Fcy::Fur基因重组质粒的构建及其对卵巢癌细胞的体外杀伤作用

目的 构建含人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子和融合型自杀基因Fcy::Fur的重组真核表达质粒并探讨它对卵巢癌细胞的体外杀伤作用.方法 ①从pORF5-Fcy::Fur质粒中PCR扩增Fcy::Fur片段,业克隆进p2XEB质粒,构建含hTERT肩动了和Fcy::Fur基因的重组真核表达质粒p2XEB-Fcy::Fur;同理,将Fcy::Fur亚克隆进pGL3-Promoter质粒,构建含猿猴病毒40(SV40)启动子和Fcy::Fur基因的重组质粒pGL3-Pro-Fcy::Fur,重组子经酶切鉴定、测序;②RT-PCR检测卵巢癌细胞SKOV3和人胚肺成纤维细胞MRC-5中hTERT mRNA的表达,荧光素酶活性分析检测hTERT启动子在2种细胞中活性;③用超声微泡作载体,将上述2种质粒分别转染SKOV3和MRC-5,与前药5-氟胞嘧啶(5-FC)共培养后,CCK-8测定转染细胞增殖抑制率;吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色观察细胞凋亡;RT-PCR检测Fcy::Fur mRNA的表达.结果 p2XEB-Fcy::Fur和pGL3-Pro-Fcy::Fur 2种重组质粒酶切和测序结果 与预期完全相符,hTERT启动子和Fcy::Fur片段测序与GenBank报道一致,且插入方向正确;SKOV3和MRC-5中hTERT mRNA表达分别为阳性和阴性,hTERT肩动子在SKOV3中活性为26.2%,在MRC-5中为0.65%;p2XEB-Fcy::Fur/5-FC系统对SKOV3的增殖抑制率明显高于MRC-5(P=0.036),而pGL3-Pro-Fcy::Fur/5-Fc系统对2种细胞的增殖抑制率无明显区别(P=0.87);转染pGL3-Pro-Fcy::Fur的SKOV3、MRC-5细胞以及转染p2XEB-Fcy::Fur的SKOV3细胞,均见大量凋亡细胞和Fcy::Fur mRNA表达,而转染p2XEB-Fcy::Fur的MRC-5少见凋亡细胞,也无Fcy::Fur mRNA表达,与前三者比较,差异有统计学意义(P<0.01).结论 含人端粒酶逆转录酶启动子和Fcy::Fur基因的重组质粒p2XEB-Fcy::Fur成功构建,p2XEB-Fcy::Furl/5-FC系统能靶向杀伤端粒酶逆转录酶阳性的卵巢癌细胞.

Construction of recombinant plasmid containing hTERT promoter and Fcy:: Fur gene and its killing effect on ovarian cancer cells