| 摘 要： | 目的设计PCR检测血小板细菌的通用引物,评价其在血小板检测中的应用效果。方法在美国国家生物技术信息中心(NCBI)中找到不同细菌中同一片段基因16Sr DNA序列,对其做多序列比对,确定合适的保守区域;使用Primer 5.0设计3对引物探针,采用荧光定量PCR对不同浓度[(101—107)CFU/m L]的标准菌株扩增,通过分析扩增曲线来判断扩增效果。分别将配制后经血小板稀释为101、102、103、104、105、106、107CFU/m L的菌悬液在22℃震荡培养24 h,以荧光定量PCR检测细菌;筛选出灵敏度和特异性最好的引物作为最终引物。结果血小板常见菌做荧光定量PCR检测[对(101—107)CFU/m L的细菌重复检测3次]后,通过对检测灵敏度和特异性的比较,发现第3号组引物(16S-F3:CAACGCG■AACCTTAC,16S-R3:AACC■CATTTCACAACA)不但能避免背景和非特异物的产生,而且能识别低含量的目标DNA,检测的细菌浓度范围含量为(102—108)CFU/m L。结论细菌通用引物的设计与筛选为血小板细菌的核酸检测方法的建立起到了关键的作用。
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