一步法流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量反转录聚合酶链反应方法的建立及应用

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的荧光定鼍RT-PCR方法.方法 根据GenBank登录的乙脑病毒毒株序列,应用生物软件在乙脑病毒基因的保守区设计与筛选引物和探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性和重复性.并通过对蚊虫样本的检测,以评价该方法的实际应用价值.结果 优化结果表明荧光定量RT-PCR的最佳反应体系为0.1 μmol/L探针浓度,0.2μmol/L引物浓度,5 mmol/L Mg2+浓度.结果 表明该方法对乙脑病毒的检测有高度的特异性、通用性,对1～4型登革热病毒、狂犬病毒、汉坦病毒(SEO型与HTN型)均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1 TCID50,重复性分析表明同一样品Gt值的重复检测4次,其标准差均在合理范围内,分别为0.033、0.079、0.149和0.411.对110批蚊虫标本进行荧光定量RT-PCR检测和病毒分离榆测,结果荧光定量RT-PCR检测出7份阳性,而病毒分离则只检测出3份阳性,表明建立的荧光定量RT-PCR方法更敏感,可直接从蚊虫样本中检测乙脑病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右,且操作简便、敏感性高.结论 研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于乙脑病原学的快速检测.