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| 绿色荧光蛋白标记重组人偏肺病毒的制备 | |
| 引用本文： | 陈昕,葛金英,步志高,赵晓东.绿色荧光蛋白标记重组人偏肺病毒的制备[J].中华微生物学和免疫学杂志,2009,29(5). |
| 作者姓名： | 陈昕 葛金英 步志高 赵晓东 |
| 作者单位： | 1. 重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所生物安全二级实验室,400014 2. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所人兽共患病实验室 3. 重庆医科大学附属儿童医院肾脏免疫科,400014 |
| 基金项目： | 国家自然科学基金霞点项目，教育部新世纪优秀人才支持计划 |
| 摘 要： | 目的 人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)可致人上、下呼吸道感染.研究利用反向遗传学技术,以带绿色荧光蛋白(GFP)标记的hMPV NL/1/00全长cDNA质粒及4种辅助质粒pCITE-N、pCITE-P、pCITE-M2.1和pClTE-L为基础,在体外制备GFP标记的重组hMPV病毒(命名为rhMPV NL/1/00 GFP).方法 采用LipofectAMINE 2000将带GFP标记的hMPV NL/1/00全长cDNA质粒以及蛋白表达质粒pcITE-N、pCITE-P、pCITE-M2.1和pcITE-L共转染BSR-T7细胞,3 d后取BSR-T7细胞上清液感染Vero-E6细胞,1-4 d后观察Veto-E6细胞出现明显细胞病变(CPE)和绿色荧光,持续观察至第10天.收集病毒上清用于病毒滴度检测.提取培养上清的病毒RNA并通过RT-PCR方法扩增病毒N基因、F基因和G基因验证所获重组病毒.结果 Vero-E6细胞接种1～4 d后观察到明显CPE和绿色荧光,随后CPE加重,荧光信号加强,持续至感染后10 d;第1、5、10、15和20代病毒的滴度波动于105.0～106.5TCID50/ml;RT-PCR检测出符合预期大小的910 bp(N)、450 bp(F)和980 bp(G)条带,经卜述片段cDNA序列测定和比对表明获得的重组病毒与hMPV NL/1/00原型病毒序列一致.rhMPV NL/1/00 GFP重组病毒在体外传代20代后,遗传信号和荧光信号均稳定.结论 采用反向遗传学技术成功拯救了具有感染性的重组hMPV病毒,为hMPV感染发病机制及疫苗研究奠定了基础. |
| 关 键 词： | 反向遗传技术 人偏肺病毒 病毒拯救 细胞病变效应 绿色荧光蛋白 |
Preparation of recombinant human metapneumovirus expressing green fluorescent protein |
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| CHEN Xin,GE Jin-ying,BU Zhi-gao,ZHAO Xiao-dong.Preparation of recombinant human metapneumovirus expressing green fluorescent protein[J].Chinese Journal of Microbiology and Immunology,2009,29(5). | |
| Authors: | CHEN Xin GE Jin-ying BU Zhi-gao ZHAO Xiao-dong |
| Abstract: | |
| Keywords: | Reverse genetics technique Human metapneumovirus Rescue of virus Cytopathic effect Green fluorescent protein |
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