| 摘 要： | 目的将提取线粒体DNA的碱变性法、Triton法、改进高盐沉淀法加以比较,以得到最方便快速提取线粒体DNA的方法.方法采用健康成年雄性Wistar大鼠,取回肠上皮细胞样本18份,每份含3×10?6细胞,每6份分别用碱变性法、Triton法、改进高盐沉淀法提取线粒体DNA,紫外分光光度法定量.再用琼脂糖凝胶电泳和线粒体ATPase6亚基基因PCR扩增产物鉴定所提取的线粒体DNA.结果3种方法提取线粒体DNA量差别明显改进高盐沉淀法量最多,为(1.26±0.23)μg;碱变性法次之,为(0.52±0.18)μg;Triton法为(0.31±0.16)μg.A260/A280均大于1.7.说明改进高盐沉淀法提取线粒体DNA具有操作简单,产量多的优点.将改进高盐沉淀法提取线粒体DNA用于PCR扩增,测定出了线粒体DNAATPase8亚基基因序列,说明该法所提取mtDNA可用于mtDNA测序.讨论和结论线粒体在细胞凋亡,衰老及程序化死亡中发挥重要作用.已在多种疾病中发现mtDNA突变.对线粒体疾病的分子遗传机理的研究可以进一步阐明这些疾病的病因,并为治疗提供理论指导.胡义德、Tamura和Palva等用碱变性法提取了人血白细胞、心肌等组织中mtDNA;戴纪刚等建立的Triton法先除去细胞核,再分离提取胞浆中mtDNA.而高盐沉淀法通过SDS(十二烷基硫酸钠)破坏细胞膜、核膜,使蛋白质变性,从而游离出核酸,EDTA抑制细胞中DNA酶的活性,蛋白酶K进一步将蛋白质降解成小肽,加入饱和乙酸钠后,绝大部分线性大分子量DNA和蛋白质在SDS作用下变性形成沉淀,环状mtDNA仍为自然状态,通过高速离心,即可得到mtDNA.3种方法各有优缺点碱变性法操作时间较短,要求条件比较严格,不易重复;Triton法通过核质分离提取mtDNA操作时间短,但产量低,易降解.而高盐沉淀法操作简单,易重复,产量多,可依需用量扩大反应体系,使mtDNA质量得以容易控制.
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