标本固定对组织总RNA和病毒RNA的影响

目的:探讨固定剂、固定时间及温度对RNA病毒感染组织总RNA的完整性、得率及病毒RNA扩增的影响。方法:实验于2004-01/2006-09在武汉大学公共卫生学院流行病学实验室及武汉大学医学院病毒研究所实验室完成。取汉坦病毒76-118株接种乳鼠的感染组织.以沉淀脱水类固定剂[本积分数为1的甲醇、体积分数为0.75的乙醇、体积分数为1的丙酮以及醛类固定剂4%的多聚甲醛磷酸缓冲液(4%PFA)、体积分数为0.1的甲醛共5种固定剂,分别在4℃和室温下固定病毒感染组织6,12.24 h和48 h。从固定后的标本中直接提取组织总RNA,检测RNA完整性及组织总RNA得率。用巢式RT-PCR扩增病毒RNA序列.电泳检测PCR产物并行灰度扫描。对RNA得率及PCR产物电泳所测灰度值进行统计学分析.反映各种固定方式对病毒RNA和细胞总RNA降解的影响。结果:①RNA完整性:与立即冰冻或新鲜组织比较,体积分数为1的甲醇固定24 h,RNA完整性损伤不明显;体积分数为0.75的乙醇、体积分数为1的丙酮固定12 h后RNA开始出现损伤带.24 h出现明显的损伤;而体积分数为0.1的甲醛、4% PFA固定6 h就开始出现明显的损伤.固定24 h几乎很难看清RNA条带。②RNA得率析因分析结果显示,不同固定剂、固定时间、固定温度下固定的组织中所提RNA的得率差异有显著性(P<0.01),并有显著性交互作用(P<0.01)4℃甲醇固定6 h的RNA得率最高,体积分数为0.1的甲醛在室温下固定48 h得率最低。③固定后标本巢式RT-PCR,除体积分数为0.1的甲醛固定48 h后扩增结果不稳定外,其余各固定方式均能扩增出特异性带。对电泳结果进行灰度扫描时.与甲醛相比.甲醇、乙醇和丙酮固定的标本中扩增的产物电泳条带更亮,灰度值更高(P<0.01)。结论:①对RNA完整性的保存沉淀脱水类固定剂明显优于醛类固定剂。②对RNA病毒感染组织固定时间不宜偏长.固定过程的温度宜选用4℃。

Effects of specimen fixed-mode on total RNA and viral RNA