绿色荧光蛋白标记的人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建与鉴定携带绿色荧光蛋白标记的人血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因的重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP。方法将hVEGF165基因进行扩增,并同源重组入表达质粒pAV-MCMV-HA-P2A-GFP,转化入DH5a感受态细胞,得到的转化子经菌落聚合酶链反应(PCR)鉴定和测序鉴定后,通过Ad Max腺病毒包装系统转染HEK293细胞,进行病毒的包装和扩增。包装后镜下观察HEK293细胞,测定腺病毒滴度,Western blot检测重组腺病毒的表达。结果成功构建了重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP,重组腺病毒转染的HEK293细胞出现了明显的细胞病变效应;获得重组腺病毒的滴度为1.106×10~8 IFU/mL;Western blot检测重组腺病毒表达在23 000左右。结论成功获得重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP,为进一步研究基因治疗脓毒症/感染性休克奠定了实验基础。