重组蛋白药物游离巯基荧光法检测方法探索、优化及验证

目的:建立一种基于荧光法测定重组蛋白药物中微量游离巯基的检测方法。方法:采用基于荧光法巯基检测试剂盒进行游离巯基检测,首先对蛋白变性条件进行摸索优化,确定了变性剂种类及变性条件,并采用重组蛋白药物进行了方法验证,结果均符合验证标准。但在采用该方法对我公司PEG-GCSF和KGF产品(分子序列中理论均含有1 mol巯基/mol蛋白)进行检测时,发现游离巯基检测值均显著低于理论值,检测值最高仅为理论值的29%,可能与蛋白分子内部包埋的游离巯基未充分暴露有关。因此,本研究在已有分析方法的基础上采用蛋白酶酶解的方式,充分暴露蛋白分子中的游离巯基,并对样品的酶切条件及其他关键参数进行了优化,对优化后的分析方法进行了方法学验证。结果:通过筛选,确定了最佳变性条件：终浓度为8 mol·L^-1尿素37℃孵育30 min。针对已知理论游离巯基含量的重组蛋白1(PEG-GCSF)和重组蛋白2(KGF)产品游离巯基检测值明显低于理论值的问题,采用蛋白酶切方式,酶切条件为蛋白酶K酶切(目的蛋白：蛋白酶K(20∶1,w:w),37℃孵育1 hr,酶解后检测巯基实测值与理论值一致。经验证该方...