乳腺癌HOXA4基因甲基化的检测及其临床意义

目的探讨乳腺癌患者HOXA4基因启动子甲基化的情况及其与临床病理特征的相关性。 方法运用NEBNext^? Ultra? RNA Library Prep Kit for Illumina^?进行基因表达芯片测序，运用随机数字表法选择2014年深圳市宝安区妇幼保健院收治的9例乳腺癌患者，分析癌组织与相应癌旁组织异常差异表达的基因。运用Illumina Infinium HD Methylation 450K Assay进行DNA甲基化测序，分析乳腺癌甲基化差异基因。基于肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库信息，分析乳腺癌的差异表达基因和差异甲基化基因。挑选显著高甲基化与低表达的基因，结合生物信息学，确定HOXA4为候选基因。运用随机数字表法收集2014—2017年深圳市宝安区妇幼保健院收治的另外86例乳腺癌患者，采用焦磷酸测序法和RT-PCR，检测乳腺癌组织及其癌旁乳腺组织中HOXA4基因甲基化率和mRNA表达，用Fisher确切概率法分析甲基化率与患者临床病理特征的关系。用Cox比例风险模型进行风险因素的单因素和多因素分析。分别用0、0.5、1、5、10、20 μmol/L的甲基化抑制剂RG108处理乳腺癌MCF-7细胞5 d后，检测HOXA4 mRNA的表达。 结果基因表达数据芯片分析发现在乳腺癌组织中有1 680个显著上调的基因和1 249个下调基因，整体水平上在不同区域乳腺癌患者甲基化水平较癌旁组织高(P均<0.001)。86例乳腺癌组织中HOXA4基因的甲基化率为94% (81/86)，其中，30例高甲基化，52例低甲基化；而在对应癌旁组织中，HOXA4基因甲基化率为57%(49/86)，其中49例低甲基化，无高甲基化(P<0.001)。有HOXA4甲基化组的癌组织样本中HOXA4 mRNA表达低于无HOXA4甲基化组的癌组织样本(P＝0.003)。HOXA4基因甲基化水平与乳腺癌淋巴结转移、ER表达有关(P＝0.039、0.017)。单因素分析结果显示患者的TNM分期、组织学分级、淋巴结转移及HOXA4甲基化是DFS的危险因素(RR＝4.008，95%CI＝1.296～12.393，P＝0.016；RR＝10.111，95%CI＝2.607～39.217，P＝0.001；RR＝4.588，95%CI＝1.201～17.523，P＝0.026；RR＝1.051，95%CI＝1.007～1.098，P＝0.024)。多因素分析显示组织学分级是乳腺癌患者DFS的独立预后因素(RR＝14.461，95%CI＝2.429～86.100，P＝0.003)。采用不同浓度的RG108来处理MCF-7细胞后，各组HOXA4 mRNA表达比较，差异有统计学意义(χ²＝4.472，P＝0.029)。 结论HOXA4基因启动子甲基化在乳腺癌的发生、发展中起着重要作用，有潜力作为新的分子生物学指标，用于乳腺癌临床诊断。

Detection of aberrant HOXA4 gene methylation in breast cancer and its clinical significance