丙型肝炎病毒core-Ant融合表达

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）core对肝细胞的转分化作用，构建可以表达HCV core—Ant融合蛋白的原核表达载体．方法：已经构建的HCV core cDNA克隆质粒为模板，用PCR技术删除终止子，通过T载体克隆法构建pGEM—T-HCVcorecDNA克隆质粒．经筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序后，通过常规分子生物学亚克隆方法，利用已有的pGEMT-Ant载体，连接Ant和HCV core cDNA在同一ORF，插入到pTE28表达载体，建立了表达HCV core和果蝇穿膜肽Ant的融合蛋白表达克隆．使用IPTG诱导方法，从表达菌中提取包涵体蛋白，复性后使用ELISA方法检测表达蛋白的抗原性．使用HRP标记的抗HCV核心抗体免疫组织化学一步法检测HCV core和HCV core—Ant融合蛋白对N1H3T3细胞的转导能力．结果：pGEM—T—HCV core—Ant cDNA克隆的酶切物理图谱及测序证实结果证实建立了果蝇穿膜肽Ant cDNA克隆和删除了终止子的HCV core cDNA克隆．亚克隆后建立的重组质粒pTE28HCVcoreAnt经限制性内切酶后，琼脂糖凝胶电泳，结果显示酶切片段大小和设计预计值一致．序列测定结果表明HCV core cDNA和穿膜肽AntcDNA处于同一ORF．通过转化BL21 DE3表达菌，IPTG诱导后，PAGE电泳成功表达了HCV core—Ant蛋白．复性后包被酶标板，间接ELISA方法检测抗HCV抗体阳性血清和正常人血清证实表达蛋白具有敏感和特异的抗原性．目标蛋白能转导进入NIH 3T3细胞显示了大量的阳性着色细胞．这些阳性着色细胞的着色颗粒主要存在细胞质中．表明构建表达HCV core—Ant融合蛋白的pET28原核表达载体成功．结论：通过分子克隆体外重组技术成功建立了表达HCV core—Ant的pTE28原核表达载体，为研究HCV core对细胞的转分化作用和HCV的致癌机制奠定了基础．

Fusion expression of HCV core-Ant

AIM:To construct a prokaryotic expression vector for HCV core-Ant and to study its effect on the transdifferentiation of hepatic stem cells. METHODS: The HCV core gene was obtained by PCR of two primers templating with each other and T-vector cloning method.The positive clone was identified and analyzed by the restriction enzyme digestion and sequencing, respectively.The recombinant vector pGEM T-ant was used to insert Ant and HCV core cDNA into restriction endonuclease enzyme and ligated with T4 ligase. Th...