熔解曲线分析检测临床常见4种革兰阳性菌的方法建立

目的 构建熔解曲线分析法同时检测4种临床常见革兰阳性病原菌,为临床感染性疾病的诊疗提供快速、敏感的分子生物学检测信息.方法 选取临床最常见的革兰阳性病原菌:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌做为本课题研究的检测菌种.根据检测菌种的不同,分别选取不同菌种的特异性靶序列,设计种特异性引物.对种特异性引物分别用标准菌株、临床分离目标菌株、临床分离非目标菌株、非细菌性病原体以及人源基因组DNA进行常规PCR扩增以及扩增产物测序,验证引物的特异性.对目标菌种引物进行荧光PCR预实验,筛选Tm值差异较大的多对引物,进行熔解曲线分析法实验,并对熔解曲线法的反应条件与反应体系进行优化.对优化后的熔解曲线法进行特异性验证.通过检测加入人血液中的不同细菌浓度对该方法进行敏感性分析.应用所构建的方法分别检测临床分离目标菌种各20株,分析每种菌种的熔解曲线图,熔点温度(Tm值)及其标准差(SD)的变化,评价所构建方法的稳定性.结果 ①对所设计的种特异性引物经常规PCR扩增产物电泳分析显示,目标菌株均有目的特异性扩增产物,非目标菌株、非细菌性病原体以及人源基因组DNA未出现特异性电泳条带.特异性扩增产物测序所得序列比对分析显示与目的菌种序列相符.②对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌的4对引物同时进行熔解曲线分析和mecA基因熔解曲线分析的条件优化结果:预变性温度94℃、120s,变性温度94℃、20s:退火温度53℃、12s;延伸温度68℃、13s;扩增循环数为40个循环,熔解曲线分析温度75℃～95℃.最佳的引物浓度为300nmol/L.③所建立的方法经特异性分析显示,上述4种目标菌种均有特异性熔解曲线,Tm值依次为81.02℃;80.32℃;82.37℃:83.10℃,峰高(cm)/峰宽(cm)均大于2.6,以此为典型的熔解曲线判断标准,则非目标菌、非细菌性病原体以及人源基因组DNA分析未见典型的熔解曲线.④方法的敏感性分析显示,上述4种目标菌和mecA基因可检测到的血液细菌浓度依次为:550、520、470、500与203CFU/mL.⑤对上述4菌和MRSA的临床分离菌各20株进行检测,结果显示,其平均Tm值依次为(80.96±0.688)℃,(80.20±0.729)℃,(82.42±0.599)℃,(83.20±0.713)℃和(80.11±0.15)℃.结论 本研究所设计的针对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和mecA基因检测引物具有较好的菌种特异性,可用于相应病原菌熔解曲线分析法的建立;所构建的熔解曲线法具有较好的特异性、敏感性和稳定性;并具有快速、简便、成本低廉的特点,可用于临床样本的检测;但葡萄球菌属内和肠球菌属内的Tm值较接近,必要时,可进一步用单对引物检测分析以鉴定到种.

Development the methods for detecting 4 species of clinical common Gram-positive pathogens by melting curve analysis

Objective The objective is to develop methods for detecting clinical common Gram-positive pathogens,which is specific,sensitive and fast for the diagnosis of infectious diseases.Methods The most common clinical Gram-positive bacteria including Staphylococcus aureus,Staphylococcus epidermidis,Enterococcus faecium,Enterococcus faecalis were selected as target bacteria.The species-specific primers were designed according to the specific target gene of different species.The specificity of species-specific prime...