无血清培养法诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞的实验条件优化选择

目的：胚胎干细胞能够在体外被定向地诱导分化为胰岛素分泌细胞的影响因素多，诱导过程复杂，诱导时间长，所得细胞数量少、功能低。通过对培养条件进行优化选择，是否可增加胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞定向分化的可控性，以便在短时间内得到数量更多、功能更强、可用于糖尿病治疗的胰岛素分泌细胞。方法：实验于2004-03／2004-10在解放军第三军医大学基础部生理学教研室完成。①小鼠胚胎成纤维细胞饲养层细胞的制备：孕13d的胎鼠制备成纤维细胞，37℃培养。当成纤维细胞生长完全融合后，用丝裂酶素处理后备用。②胚胎干细胞的培养及扩增：胚胎干细胞接种于小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，培养于含白血病抑制因子和胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle高糖培养基中，37℃培养四五天。③胚胎体向神经前体细胞分化的诱导：扩增培养四五天的胚胎干细胞用胰蛋白酶消化后，于不含白血病抑制因子的培养基中悬浮培养4d，形成胚胎体。收集胚胎体后接种于无血清的选择性培养基，贴壁培养四五天后，细胞分化为神经前体细胞。④神经前体细胞向胰岛素分泌细胞分化的诱导：神经前体细胞用胰岛素分泌细胞无血清选择性培养基培养4d，再用葡萄糖刺激，神经前体细胞分化为胰岛素分泌细胞。⑤不同分化阶段的细胞检测：用形态学观察、免疫组织化学染色、碱性磷酸酶染色、双硫腙染色等方法。结果：①胚胎干细胞经四五天的培养扩增后，可形成细胞致密、形态饱满、折光度高、边界限清楚的典型胚胎干细胞集落，集落呈碱性磷酸酶染色阳性，饲养层细胞不着色。②胚胎干细胞脱离饲养层后，在不含白血病抑制因子的培养基中悬浮培养四五天，可形成球形的胚胎体。胚胎体在无血清神经前体细胞选择性培养基中贴壁培养四五天后，存活细胞85％以上分化为巢蛋白阳性的神经前体细胞。③改用胰岛素分泌细胞无血清选择性培养基培养后，多突起的神经前体细胞逐步变圆，成为细小的圆形细胞。圆形细胞逐步聚集成集簇状，经葡萄糖刺激后，这些细胞最终分化为具有胰岛素分泌细胞特征的双硫腙染色阳性细胞。结论：用无血清培养法将小鼠胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞，增加了实验因素的可控性，使其中最关键的神经前体细胞的比例达到85％以上，整个诱导过程仅需12～15d，增加了胚胎干细胞用于糖尿病治疗的临床运用可行性。

Experimental condition optimization study on inducing mouse embryonic stem cells differentiation into insulin producing cells by serum-free culture in vitro