转铁蛋白增强靶向性非病毒载体K16GRGDSPC介导外源基因对骨髓基质干细胞的转染和表达

目的：检测转铁蛋白能否增强新型靶向性非病毒载体K16GRGDSPC寡肽介导外源基因对骨髓基质干细胞的转染和表达，优化寡肽载体的转染条件，为下一步利用寡肽载体构建载基因基质材料进行骨缺损修复提供实验依据。 方法：实验于2004-10／2005-01在协和医院骨科实验室完成。①用固相合成法合成K16GRGDSPC寡肽并用质谱仪和高压液相色谱仪进行检测。②新西兰大白兔麻醉后无菌条件下自股骨大转子处抽取骨髓2mL，1500g离心收集细胞，加入含体积分数0．2新生牛血清的DMEM混悬细胞于培养瓶中常规培养。48h后更换培养基，除去未贴壁细胞，细胞生长至85％融合后传代。③应用转化生长因子真核表达载体pcDNA3-TGFβ1和增强型绿色荧光蛋白真核表达载体pcDNA3-EGFP，观察转铁蛋白对K16GRGDSPC寡肽介导上述两种质粒转染骨髓基质干细胞的转染及表达效率的影响。 结果：①寡肽的分子量和纯度检测：质谱图显示肽平均分子质量为2741．3307m／z，与理论上计算设计合成肽的平均分子质量一致，高压液相色谱仪示合成肽的纯度为94％-95％。②转铁蛋白、寡肽载体、质粒DNA三者形成复合物的电泳鉴定结果：将1峙寡肽载体分别与10μg或20μg转铁蛋白及2μgpcDNA3-TGFβ1混合后电泳，结果显示三者混合物的电泳迁移率均低于不加转铁蛋白的空白对照，且加20μg转铁蛋白较加10μg转铁蛋白的电泳迁移率更低。说明带正电荷的转铁蛋白与寡肽载体和质粒DNA形成了复合物。③转铁蛋白增加K16GRGDSPC寡肽转染效率：2μg pEGFP质粒与6μg K16-GRGDSPC寡肽加5-45μg转铁蛋白转染骨髓基质干细胞，转染效率随转铁蛋白浓度的增加而逐步提高，在25μg时转染效率达到最大，进一步增高转铁蛋白浓度，转染效率并不增加。④转化生长因子β1活性检测结果：体外以6μg K16GRGDSPC寡肽加25μg转铁蛋白介导2μg pcDNA3-TGFβ1转染骨髓基质干细胞，转染72h后测得明显高于未加转铁蛋白的转化生长因子β1的表达量（644&;#177;4．3），（48．6&;#177;3．5）μg/L，P〈0．01]。 结论：转铁蛋白能与载体K16GRGDSPC和质粒DNA形成复合物，且显著增强K16GRGDSPC寡肽介导外源基因在骨髓基质干细胞中的转染和表达。

Enhancement of target non-viral vector K16GRGDSPC-medi- ated gene transfection and expression in bone marrow stromal cells by transferrin