GGTA1/β4GalNT2双基因敲除近交系五指山小型猪的建立

目的：利用CRISPR/Cas9技术建立五指山小型猪近交系GGTA1/β4GalNT2双基因敲除克隆猪。方法：设计合成靶向猪GGTA1和β4GalNT2基因的单导向RNA（single guide RNA，sgRNA），以pX330质粒为骨架，分别构建GGTA1和β4GalNT2的Cas9打靶载体，转染至近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast，PFF）中，通过G418药物筛选和测序鉴定获得双基因敲除的单细胞克隆，然后利用体细胞克隆技术（somatic cell nuclear transfer，SCNT）获得双基因敲除的近交系五指山小型猪，并利用流式细胞技术检测克隆猪外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中αGal和Sd（a）抗原的表达。结果：成功构建GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表达载体，转染后获得双基因敲除的近交系五指山小型猪PFF细胞克隆 9个。SCNT成功获得了10只五指山小型猪近交系双基因敲除的克隆猪，其 PBMC无αGal和Sd（a）抗原的表达。结论：CRISPR/Cas9技术可以实现对猪GGTA1/β4GalNT2基因的编辑。本实验首次成功制备了GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的近交系五指山型猪，为异种器官移植研究与应用提供了新的供体材料。