梅毒螺旋体Tp0453特异性抗原优势表位区段的克隆表达及其在血清学诊断中的初步评价

目的 应用基因工程技术在大肠埃希菌中表达梅毒螺旋体(Tp) Tp0453(62～224位氨基酸)重组蛋白,为提高梅毒血清学诊断试剂的特异性提供实验基础.方法 采用PCR法从Tp全基因组中扩增目的片段Tp0453(第184～672位核苷酸),T-A克隆后构建原核表达质粒pQE30-Tp0453,酶切鉴定后转化E.coli M15,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达,Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白,表达产物经Western印迹鉴定其免疫反应性.以纯化的重组抗原建立双抗原夹心法ELISA,检测经Tp抗体明胶颗粒凝集试验(TPPA)法确证的梅毒阳性血清48份、阴性血清40份.结果 PCR法扩增出约490 bp目的片段,成功构建原核表达质粒pQE30-Tp0453,并在E.coli M15中表达,蛋白表达率为18％,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳初步测定目的蛋白的相对分子质量为21 000,破菌后电泳证实目的蛋白以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度＞95％,Western印迹证实该蛋白能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应.双抗原夹心法ELISA检测88份临床标本,灵敏度为97.9％(47/48),特异度为100.0％(40/40),与TPPA的总符合率为98.9％(87/88).结论 所表达的Tp0453重组蛋白具有良好的免疫反应性,为开发临床检测效果更好的梅毒诊断试剂盒提供了实验基础.

Gene cloning and expression of the Tp0453 antigen immuno-dominant epitope fragment of Treponema pallidum and its potential use in serodiagnosis of syphilis