软骨中硫化氢含量及其对白介素1β诱导的软骨细胞基质金属蛋白酶13表达的抑制作用

目的：研究关节液及关节软骨中硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）及其合成酶的含量和变化，以及H2S对白介素1β（interlukin-1β，IL-1β）诱导的软骨细胞人基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）表达的影响。方法：收集在北京大学第一医院行膝关节手术（关节镜手术或膝关节置换术）患者的关节液及废弃的关节软骨，用亚甲基蓝法检测关节液H2S的含量；从废弃的关节软骨中分离出相对正常的软骨细胞，用H2S分子探针方法检测软骨细胞中的内源性H2S，用免疫细胞化学方法检测软骨细胞中H2S合成酶胱硫醚-β-合成酶（cystathionine beta-synthase，CBS）、胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine gamma-lyase，CSE）、巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，MPST）；用Western blot法检测H2S合成酶CBS、CSE、MPST在不同退变程度的软骨组织中的含量。培养相对正常的人软骨细胞至第三代，分为4组：（1）对照组：不加任何药物；（2）IL-β组：单加5 μg/L的IL-1β；（3）IL-1β+H2S组：提前0.5 h加200 μmol/L的NaHS，再加5 μg/L的IL-1β；（4）H2S组：单加200 μmol/L的NaHS。Western blot法检测各组细胞MMP-13蛋白、总核因子κB p65（nuclear factor κB p65，NF-κB p65）及磷酸化NF-κB p65蛋白的含量，Real-time PCR检测各组细胞MMP-13基因的转录情况。结果： 退变膝关节的关节液中H2S含量为(14.3±3.3) μmol/L，Outerbridge分级3级软骨组织中CSE表达量显著高于Outerbridge分级1级软骨组织中的表达量（1.67±0.09 vs. 1.26±0.11，P＜0.01），而CBS与MPST的表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。IL-1β组MMP-13的表达较正常对照组明显升高，且差异具有统计学意义（1.87±0.67 vs. 0.22±0.10，P＜0.05）, IL-1β+H2S组MMP-13的表达较IL-1β组明显降低，且差异具有统计学意义（0.55±0.11 vs. 1.87±0.67，P＜0.05），H2S组MMP-13的表达较正常对照组差异无统计学意义。 Real-time PCR方法测量了药物干预实验中各组细胞MMP-13基因转录情况，结果显示IL-1β组MMP-13基因转录较正常对照组明显升高，且差异具有统计学意义（31.40±0.31 vs. 1.00±0.00，P＜0.05）, IL-1β+H2S组MMP-13基因转录较IL-1β组明显降低，且差异具有统计学意义（24.41±1.28 vs. 31.40±0.31，P＜0.05）， H2S组MMP-13基因转录较正常对照组无显著性变化。IL-1β组总p65含量较正常对照组明显升高，且差异具有统计学意义（2.13±0.08 vs. 0.73±0.08，P＜0.05）, IL-1β+H2S组总p65含量较IL-1β组明显降低，且差异具有统计学意义（1.24±0.13 vs. 2.13±0.08，P＜0.05）， H2S组总p65含量较正常对照组无显著性变化；IL-1β组磷酸化p65含量较正常对照组明显升高，且差异具有统计学意义（1.30±0.13 vs. 0.19±0.04，P＜0.05）, IL-1β+H2S组磷酸化p65含量较IL-1β组明显降低，且差异具有统计学意义（0.92±0.26 vs. 1.30±0.13，P＜0.05），H2S组磷酸化p65含量较正常对照组无显著性变化。结论： H2S参与了软骨退变，起到部分抑制细胞外基质降解酶MMP-13的作用，从而实现对软骨细胞外基质的保护。