| 摘 要： | 目的构建HJURP基因的RNA干扰慢病毒表达载体并在人胚胎绒毛细胞上鉴定其沉默效率,进而提供HJURP基因缺陷表达的原代胚胎绒毛细胞模型。方法针对目的基因HJURP的序列,按照RNA干扰序列的设计原则,设计合成3个HJURP基因特异性的小分子干扰RNAi靶点,将其合成短发夹RNA(sh RNA)并退火形成双链RNA,克隆至慢病毒载体中形成sh RNA表达载体,通过PCR和测序鉴定获取正确重组载体。将筛选出的重组载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞并测定病毒滴度。随后将其干扰人胚胎绒毛细胞,采用Western blotting和real-Time PCR检测靶基因的沉默效率。结果对重组载体p HBLVU6-Zs Green-Puro进行测序鉴定,证实插入的sh RNA序列无碱基变异。重组慢病毒载体经293T细胞包装后,病毒滴度为108PFU/ml。RNA干扰人胚胎绒毛细胞HJURP基因后,可见感染后内源HJURP的蛋白表达水平显著下降,HJURP m RNA水平明显下降,其中sh RNA1干扰效率大于70%。结论成功构建了HJURP基因的sh RNA慢病毒表达载体,该重组载体可以在细胞水平有效沉默靶基因,为后续研究HJURP基因表达抑制对人胚胎绒毛细胞的增殖凋亡和染色体分离的影响,探索HJURP基因在自然流产发生中的作用机制提供细胞模型。
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