改良通用茎环引物筛查和定量检测微小RNA方法的建立

目的 建立可同时筛选和定量检测成熟型miR的荧光定量PCR方法.方法 改良通用茎环引物,在其茎环尾端引入8个随机碱基片段,用于成熟型miR逆转录,以建立SYBR Green PCR筛选和定量检测miR的方法(简称“改良通用茎环引物miR法”).同时,采用10倍梯度稀释的miR-155标准品cDNA(1～109拷贝/μl)评价其灵敏度；采用熔解曲线评价其检测miR-155的特异性；通过对2×105、2×106、2×107拷贝/μl的miR-155标准品cDNA分别进行批内20次重复实验,以其循环阈值(Ct)的变异系数(CV)评价其精密度；并与传统茎环法进行比较,计算实验所用时间和引物成本.然后,采用改良通用茎环引物miR法对植物血凝素(PHA)刺激培养0、16、24、48、72 h的人外周血T淋巴细胞内miR进行筛选(87个靶miR,经PubMed检索可能与免疫功能相关),并用以进行miR定量检测分析.结果 建立的改良通用茎环引物法的最低检测限为103拷贝/μl的miR-155 cDNA标准品；熔解曲线于80℃呈单峰,证实为针对miR-155的特异性扩增；其批内重复实验的精密度为CV＜2.5％.优化后的通用引物方法与传统方法相比较,节约引物约75％(1 917 bp比7 851 bp),节省逆转录时间约120min(85 min比205 min).用改良通用茎环引物法筛选T淋巴细胞中87个miR,85个miR在PHA刺激前、后的Ct无变化,而miR-150和miR-155表达量在T淋巴细胞激活前后分别发生超过10倍下降(72 h)和8倍的升高(48 h),且差异有统计学意义(Z=-2.023,P=0.043;Z=-2.032,P=0.042).结论 建立的改良通用茎环引物miR法具有快速、重复性好、灵敏、节约引物用量和实验时间的优点,可用于T淋巴细胞的miR筛查和定量检测.

The application of universal stem loop primer for microRNA scanning and quantification