体外修复血管平滑肌细胞的方法学研究

目的:采用不同方法体外培养人脐动脉平滑肌细胞,选择以获得体外修复受损平滑肌细胞的最佳方法。方法:实验于2004-12/2005-10在哈尔滨医科大学附属第一医院实验中心卫生部细胞移植重点实验室进行。①取新生儿脐带约5cm长(家属志愿提供)原代分离血管平滑肌细胞;分别用贴块法和胰酶/胶原酶酶解法分离、培养血管平滑肌细胞。②贴块法:将血管平滑肌细胞组织块20%M199完全培养基(200mL/L胎牛血清 10mL/L双抗 5mL/LL-谷氨酰胺)贴壁24h后,补足完全培养基培养;胰酶/胶原酶酶解法:第1步胰酶消化:将脐动脉剪成1mm×1mm大小。装入含2.5g/L胰酶培养瓶中,消化15～30min,加入20%M199完全培养基终止消化。第2步胶原酶消化:将上述处理过的组织块放入含1g/LⅠ型胶原酶的无血清M199培养基中,过夜,离心,收集细胞,以1×104个细胞/cm2密度接种培养皿中,补足20%M199完全培养基培养。③对两种方法培养的细胞生长形态、数量及平滑肌а-肌动蛋白表达情况进行观察和检测。结果:①贴块法:组织块种植后2周时,多数细胞已贴壁伸展。4～6周细胞达80%融合时,镜下成“峰与谷”样,可传代培养,传代间隔期一般是两三周;胰酶/胶原酶酶解法:细胞多为伴有胞质突起的多角形大细胞,达到生长融合时细胞密度低。2周左右细胞融合,可传代培养。传代间隔期一般是一两周。②贴块法获得的细胞初期生长速度慢,但达到融合前细胞数量多,细胞得率高;胰酶/胶原酶酶解法获得的细胞初期生长速度快,群体倍增时间短,但达到融合前细胞数量少于贴块法,细胞得率低。③胰酶/胶原酶法α-肌动蛋白阳性细胞率高于贴块法(93.1%,71.4%,χ2=4.626,P<0.05)。结论:两种方法均可成功培养人血管平滑肌细胞;贴块法合成表型细胞比例大,胰酶/胶原酶酶解法收缩表型细胞比例大,后者所获得的细胞更适合用作修复血管平滑肌细胞的种子细胞。

Methodological study on the in vitro repair of vascular smooth muscle cells