大鼠真皮成纤维细胞肌肉转录调节因子基因转染后生物学特性观察

背景：利用转基因技术诱导皮肤真皮成纤维细胞分化为特殊器官组织功能的前驱细胞具有重要意义。 目的：观察肌肉转录调节因子（myogenic determination，MyoD）基因转染对大鼠真皮成纤维细胞生物学特性的影响。 设计、时间及地点：单一样本观察，细胞基因工程学实验，于2005-01/2007-02在同济大学附属东方医院心胸外科和细胞治疗室完成。 材料：清洁级雄性SD大鼠6只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。Ⅱ型胶原蛋白酶为GIBCO公司产品，稻瘟菌素粉剂为美国Promega公司产品，慢病毒载体pLenti6/V5-DEST为Invitrogen公司产品，BrdU为美国Sigma公司产品。 方法：无菌条件下切取大鼠腹侧全层皮肤，采用200 IU/mL的Ⅱ型胶原蛋白酶在4 ℃下解离大鼠皮肤真皮组织，组织块培养法获取贴壁的真皮成纤维细胞，待生长近融合状态时传代扩增。取传至第3~6代细胞，利用携带MyoD cDNA的真核表达载体pLenti6/V5-DEST-MyoD进行转染，经终浓度为50 mg/L稻瘟菌素筛选后，挑选转基因单克隆细胞传代培养，向细胞培养液中加入10 μmol/L BrdU于37 ℃条件下孵育48 h。 主要观察指标：细胞形态学观察，免疫细胞化学染色鉴定，体外BrdU标记情况。 结果：体外分离培养的真皮成纤维细胞纯度高，形态良好，生长增殖功能正常，转染后经稻瘟菌素筛选2周即可见克隆形成。光镜下真皮成纤维细胞免疫细胞化学染色后波形蛋白呈阳性表达，转染MyoD基因后肌动蛋白亦呈阳性表达。 10 μmol/L BrdU孵育48 h的标记率> 98%，且连续传代5次后仍可检测到BrdU阳性细胞。 结论：真核表达载体成功介导MyoD基因转染体外分离培养的大鼠真皮成纤维细胞，并诱导其转化为具有潜在功能的类骨骼肌细胞，可在体外稳定生长扩增。

Biological characteristics of rat dermal fibroblasts following transfection with myogenic determination gene