携带低氧诱导因子1αmu和人源化海肾绿色荧光蛋白双基因真核表达载体 构建及其在HEK293A细胞中的表达*

背景：低氧诱导因子1能够调控多种基因共同表达，在骨缺损部位可诱导成熟的血管生成，为各种细胞的成骨分化和成骨活动提供营养支持和代谢保证，促进骨愈合，但其真核表达载体的构建及表达却少见报道。 目的：实验拟构建携带低氧诱导因子1αmu(hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α)目的蛋白和人源化海肾绿色荧光蛋白(human renilla reniformis green fluorescent protein，hrGFP)的双基因真核表达载体，并将其转染HEK293A细胞，观测其在细胞中的表达。 方法：利用PCR技术定点突变目的基因供体质粒pCMV6-XL5-HIF1α携带的人HIF1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸以及去掉其终止密码子，之后在基因序列前后添加新的酶切位点Not Ⅰ和Pvu Ⅰ，酶切、测序检测突变情况，将正确突变的HIF1αmu定向连入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1中。经测序鉴定、Pme Ⅰ酶切线性化后转化BJ5183-AD-1电感受态细胞，通过hrGFP基因荧光表达检测转染情况。 结果与结论：经基因测序证实，HIF-1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸均定点突变成丙氨酸，终止密码子成功去除。经酶切鉴定及测序证实，重组腺病毒表达载体构建成功。荧光显微镜下观察表明，感染重组腺病毒的HEK293A细胞内有大量绿色荧光表达证实通过Lipofectamine 2000途径可使得重组腺病毒载体成功转染HEK293A细胞。 关键词：低氧诱导因子1α；基因突变；腺病毒载体；绿色荧光蛋白；HEK293A细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.46.011

Construction of double gene eukaryotic expression vector carrying hypoxia inducible factor 1 alphamu and human renilla reniformis green fluorescent protein and its expression in HEK293A cells