血管生成抑制因子人内皮抑素基因的克隆与原核表达

目的:构建血管生成抑制因子人内皮抑素非融合蛋白大肠杆菌表达载体。方法:实验于2004-02/12在中山大学生命科学院医药分子生物学实验室完成,表达质粒由中山大学医药分子实验室保存,肝细胞来源于南方医科大学珠江医院引产胎儿肝脏。用反转录多聚合酶链反应得到人内皮抑素全基因,连接PGEM-T载体,在16℃下以进行16h连接反应,转化大肠杆菌DH5α,对所获克隆扩大培养,提取质粒经EcoRI,BamHI酶切鉴定。将带有插入片段的重组质粒命名为PGEM-Tendo。对其阳性克隆扩大培养,大量提取质粒,以T7,SP6为测序引物进行全自动正、反向测序确认。将PGEM-Tendo质粒及表达载体pBV220经EcoRI,BamHI酶切后定向连接,转化入大肠杆菌DH5α,聚合酶链反应鉴定阳性克隆,命名为pBV220-endo。将含pBV220-endo的DH5α工程菌在30℃小量培养,经42℃热诱导4h后收菌,对所收菌和诱导前细菌进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶。离心收集菌体并超声破碎,将超声后的上清液和沉淀进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果:反转录—聚合酶链反应获得内皮抑素基因含酶切位点约573bp,用EcoRI,BamHI双酶切,10g/L琼脂糖凝胶电泳上可见约为552bp的内皮抑素片段和约为3000bp的PGEM-T载体片段,说明内皮抑素已成功构建在PGEM-T载体上。经全自动正、反向测序,Genbank分析证实,所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素功能区段基因,该基因的第471位氨基酸编码碱基由G突变为A,但编码的氨基酸都是精氨酸,经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,出现特异性蛋白质条带,大小与人内皮抑素蛋白大小相符合。非融合重组蛋白内皮抑素主要以不溶的包涵体形式表达,表达量为14.5%。结论:克隆的552bp的内皮抑素基因,经与GenBank中人胶原XVIIIcDNA中内皮抑素基因比较,基因序列基本一致,说明人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达,为应用内皮抑素进行抗血管生成基因治疗奠定了实验方法学基础。

Human angiogenesis inhibitor endostatin gene cloning and expression of pronucleus