Tipα基因原核表达质粒的构建及其诱导条件的优化

目的 构建肿瘤坏死因子α诱导蛋白(Tipα)基因的原核表达载体,并优化诱导实验条件使其在大肠杆菌中表达.方法 提取幽门螺杆菌(H pylori) 26695菌株总DNA,用PCR方法扩增位于H.pylori 0596的Tipα基因编码序列.将Tipα基因与pET29a载体同时经BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切、纯化及连接后,构建pET29a-Tipα原核表达质粒,转化至宿主菌Top10F'中.优化实验条件使pET29a-Tipα原核质粒表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot方法进行鉴定.结果 pET29a-Tipα原核表达质粒经双酶切证实插入片段分子量为519 bp DNA条带,测序结果与H.pylori 0596的Tipα基因编码序列相一致.当诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度为1.0 mmol/L,30℃诱导培养4h时,诱导目的蛋白表达量最高.Western blot结果证实,表达的重组蛋白可与Tipα抗体产生分子量约为21.8 KD的特异性条带.结论 成功构建了pET29a-Tipα原核表达质粒,并优化实验条件使其在大肠杆菌中表达了Tipα重组蛋白.