冻存复苏条件对髓性白血病细胞株生物学特性的影响

目的:采用不同方法对白血病HL60细胞株进行冻存和复苏,观察生物学特性改变,筛选最佳冻存复苏方案。方法:实验于2006-04/06在吉林医药学院临床检验实验室(国家三级标准)进行。①HL60细胞株由中国科学院上海生物细胞研究所提供。将欲冷冻保存的HL60细胞调整到良好的生长状态(对数生长期),随机数字表法分成4组,离心收集后在含体积分数为0.1小牛血清的RPMI-1640培养基中分别加入二甲基亚砜,使其终浓度依次为50,100,150,200g/L。冻存15d后,每组取1支冻存管复苏并接种于细胞培养板,培养12h后用锥虫蓝拒染法计算细胞复苏率。②选择冻存条件和冻存细胞密度相同的两支冻存管,按不同方法进行HL60细胞复苏。37℃水浴传统复苏法:立即将冻存管置于37℃水浴中,待融化后800r/min离心5min,吸去上清液,加入含体积分数为0.1小牛血清的RPMI-1640培养基,混匀后接种于细胞培养板,1mL/孔,9孔/组,置于体积分数为0.05的CO2培养箱37℃继续培养。40℃溶解后再37℃恒温改良复苏法:将冻存细胞于40℃水浴中迅速溶解,转入37℃水浴箱,融化后离心、加培养基等操作同传统复苏法。复苏细胞培养12h后采用锥虫蓝染色计算细胞存活率。③用无血清RPMI-1640培养基制备HL60细胞悬液,按3×107L-1密度接种于细胞培养板中,1mL/孔,然后分别加入体积分数为0.05,0.1,0.12,0.15,0.2的灭活小牛血清,每种血清浓度设置8个试验孔,并分别于培养12,24,36,48,60,72,84,96h后计数每孔细胞数量,并绘制细胞生长曲线。结果:①不同浓度二甲基亚砜冻存后HL60细胞复苏率的比较:二甲基亚砜200g/L组的细胞复苏率明显低于二甲基亚砜50,100,150g/L组(64.6±2.8)%,(87.0±1.4)%,(86.4±2.1)%,(85.7±2.8)%;t=25.44,P<0.01],二甲基亚砜50,100,150g/L组间差异无显著性意义(t=0.82～1.44,P>0.05)。②不同复苏方法HL60细胞存活率的比较:与37℃水浴传统复苏法比较,40℃溶解后再37℃恒温改良复苏法的细胞存活率显著升高(69.5±1.5)%,(87.4±1.8)%,t=23.24,P<0.01]。③RPMI-1640培养基不同血清含量对HL60细胞生长情况的影响:在体积分数为0.05的血清含量培养基中,HL60细胞基本不生长,且有逐渐死亡的趋势;在体积分数为0.1的血清含量培养基中,HL60细胞生长趋势明显,但生长速度相对较慢;在体积分数为0.12,0.15,0.2的血清含量培养基中,HL60细胞生长迅速,3种血清浓度间细胞生长趋势无明显差异。结论:以50g/L二甲基亚砜作为HL60细胞冻存保护剂、联合40℃溶解后再37℃恒温改良复苏法可使细胞保持最佳生物学特性,体积分数为0.12的血清含量为HL60细胞常规培养的最适浓度。

Biological characteristics of myeloid leukemia cells under different cryopreservative and resuscitative conditions