| PKCI-1/HINT1表达质粒的构建及其对黑素瘤A375细胞凋亡及自噬影响的初步研究 |
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| 引用本文： | 倪娜娜,温斯健,张韡,姜祎群,孙建方.PKCI-1/HINT1表达质粒的构建及其对黑素瘤A375细胞凋亡及自噬影响的初步研究[J].中华皮肤科杂志,2016(5):348-352. |
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| 作者姓名： | 倪娜娜 温斯健 张韡 姜祎群 孙建方 |
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| 作者单位： | 中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所病理科,南京,210042 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金(81272992)，江苏省自然科学基金(BK20131063)，高等学校博士学科点专项科研基金(20121106110040)National Natural Science Foundation of China(81272992)，Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China(BK20131063)，Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China(20121106110040) |
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| 摘 要： | 目的 构建人PKCI-1/HINT1基因的真核表达质粒,研究其在人黑素瘤A375细胞株中的表达并检测其对A375细胞凋亡及自噬的影响.方法 以人黑素瘤细胞A375的总RNA为模板,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增PKCI-1/HINT1基因序列,将PKCI-1/HINT1基因克隆到真核表达载体PCDNA3.1(+)中,构建PCDNA3.1(+)-PKCI-1/HINT1重组体.将PCDNA3.1(+)-PKCI-1/HINT1表达载体瞬时转染黑素瘤A375细胞,RT-PCR及Western印迹检测PKCI-1/HINT1在细胞内的表达,并以PCDNA3.1(+)空载体转染细胞作为相应对照组.噻唑蓝(MTT)检测PKCI-1/HINT1转染后细胞的增殖变化,Hoechest 33258染色检测细胞凋亡,采用绿色荧光蛋白-微管相关蛋白轻链3(GFP-LC3)标记结合激光共聚焦显微镜法检测PKCI-1/HINT1对细胞自噬的的影响,并通过Western印迹检测PKCI-1/HINT1对细胞内caspase 3及自噬相关蛋白beclin1蛋白表达的影响.结果 PCDNA3.1 (+)-PKCI-1/HINT1真核表达载体经酶切及测序鉴定构建成功,并能够在细胞内有效表达.MTT检测发现PKCI-1/HINT1能够明显抑制A375细胞的增殖,与PCDNA3.1(+)对照组相比,在48 h,72 h及96 hPCDNA3.1 (+)-PKCI-1/HINT1组活细胞数分别减少17.0％,25.6％、29.4％,差异有统计学意义(均P＜0.05).Hoechest 33258染色显示PKCI-1/HINT1可促进A375细胞内凋亡小体形成.激光共聚焦显微镜发现PKCI-1/HINT1的过表达可使A375细胞内GFP-LC3B的点状聚集增加.Western印迹发现,PKCI-1/HINT1可促进细胞内caspase 3及beclin1蛋白表达.结论 成功构建真核表达载体PCDNA3.1 (+)-PKCI-1/HINT1并在细胞内有效表达PKCI-1/HINT1.PKCI-1/HINT1的高表达可以抑制A375细胞增殖,促进其凋亡,同时可引发A375细胞的自噬过程.
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| 关 键 词： | 黑色素瘤 细胞系 肿瘤 细胞凋亡 自噬 PKCI-1/HINT1 |
Construction of a eukaryotic expression plasmid carrying the PKCI-1/HINT1 gene and its effects on apoptosis and autophagy of A375 melanoma cells |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Melanoma Cell line tumor Apoptosis Autophagy PKCI-1/HINT1 |
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