von Hippel-Lindau(VHL)的表达、纯化及结合活性分析

目的纯化人von Hippel-Lindau(VHL)基因重组蛋白并进行功能鉴定。方法采用PCR从人乳腺c DNA中获得VHL基因序列,该序列被插入到原核表达载体p GEX-KG中,得到谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-VHL重组质粒,将其转化至BL21(DE3)感受态细菌,经小量诱导后,采用SDS-PAGE和Western blot法检测该蛋白表达情况,使用GST微珠纯化该重组蛋白,利用GST pull-down技术验证其功能。结果获得的重组质粒可成功双酶切,基因测序表明VHL序列正确且无突变;将其转化至BL21(DE3)感受态细菌并小量诱导,纯化得到相对分子质量(Mr)约56 000的重组蛋白; GST pull-down技术证明GST-VHL重组蛋白在体外具有结合缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的功能。结论纯化出GST-VHL重组蛋白并可与HIF-1α蛋白在体外结合。