Pokemon基因siRNA逆转录病毒的制备及其对Hela细胞增殖的影响

目的 针对多种肿瘤细胞高表达Pokemon基因的特性,制备表达针对Pokemon基因的siRNA的逆转录病毒,研究其对感染肿瘤细胞中Pokemon基因沉默情况,探讨肿瘤防治的新方法.方法 首先利用siRNA预测软件得到4条siRNA编码DNA序列,再构建重组逆转录病毒siRNA表达质粒;利用RT-PCR技术筛选出高表达Pokemon基因的肿瘤靶细胞.然后,将重组质粒转染靶细胞,利用实时定量RT-PCR和MTT等方法筛选出沉默效果最佳的siRNA.利用逆转录病毒包装细胞制备重组病毒,鉴定病毒滴度及其对体外培养细胞中Pokemon基因的沉默效应.结果 通过酶切鉴定和测序等方法证实了预测出的四条siRNA编码DNA片段成功地构建到逆转录病毒表达载体pSilencer 5.1-H1中.通过将这些重组质粒转入高表达Pokemon基因的Hela肿瘤细胞中,抗生素压力筛选出相应表达各种siRNA的细胞株,再从中筛选出了1个有50%以上沉默效应的候选siRNA.利用这一条siRNA表达质粒,在逆转录病毒包装细胞中制备出了滴度为105cfu/mL的重组病毒.此重组病毒感染Hela细胞后能显著降低其中Pokemon基因的表达.结论 成功制备了表达人Pokemon基因siRNA的重组逆转录病毒,并且在体外实验中证实了该病毒能对肿瘤细胞Hela的增殖产生明显的抑制作用,为下一步的体内抗肿瘤研究提供了有力的佐证.

Preparation the recombinant retrovirus expressing siRNA of Pokemon gene and the suppression on Hela cell proliferation