壳聚糖介导真核双表达质粒plRES—hVEGF｜2｜cDNA／hBMP-4转染兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

背景：发展一种安全有效的方法来促进骨缺损是修复重建外科面临的重要问题,自体骨移植仍是目前优先考虑的选择,但供区有限且不可避免地对供区造成新的损害;同种异体骨移植存在免疫排斥反应;非骨性材料移植物在临床实践中的并发症仍居高不下。目的：探讨壳聚糖介导真核双表达质粒pIRES-hVEGF｜2｜cDNA/hBMP-4转染兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的可行性。设计、时间及地点：细胞基因工程学体外实验,于2007-09/2008-04在安徽医科大学与中国医科大学完成。材料：清洁级新西兰大白兔8只,由安徽医科大学实验动物中心提供。壳聚糖介导的真核双表达质粒pIRES-hVEGF｜2｜cDNA/hBMP-4为课题组自行构建。方法：无菌条件下抽取兔骨髓,Percoll法体外分离培养骨髓间充质干细胞,通过换液和贴壁吹打法进行纯化扩增。第3代骨髓间充质干细胞80%融合后,按1×10^8L^-1密度接种,实验组采用壳聚糖介导的真核双表达质粒pIRES-hVEGF｜2｜cDNA/hBMP-4进行转染,对照组不转染质粒,继续以含10%FBS的L-DMEM普通培养基进行培养21d。主要观察指标：碱性磷酸酶及茜素红染色检测细胞分化情况,扫描电镜观察细胞结构变化。结果：转染14d后实验组碱性磷酸酶染色呈强阳性表达,茜素红染色出现大量棕红色的钙结节,电镜观察细胞内含有大量碱性磷酸酶的小泡,细胞周围大量基质分泌;对照组碱性磷酸酶与茜素红染色均呈阴性,电镜下细胞内几乎没有含碱性磷酸酶的小泡。结论：兔骨髓间充质干细胞在体外经壳聚糖介导的真核双表达质粒pIRES-hVEGF｜2｜cDNA/hBMP-4转染后,可定向分化为成骨细胞。