氯通道阻滞剂对N-甲基-D-天冬氨酸诱导离体海马神经元凋亡的保护作用

目的：观察氯通道阻断剂4-乙酰氨基-4’-异氰酸芪-2，2乙二磺酸（SITS）对N-甲基-D-天冬氨酸诱导大鼠离体海马神经元凋亡的保护作用。方法：实验于2004—09／12在南方医科大学神经生物教研室完成。新生1dSD大鼠64只，无菌断头取双侧海马，胰酶消化，离心，筛网过滤，把神经元种植在967L或247L培养板内。取离体培养12d的神经元，随机分为正常对照组、N-甲基-D-天冬氨酸组、N-甲基-D-天冬氨酸处理时加SITS组和N-甲基-D-天冬氨酸处理后加SITS组。除正常对照组外，其他各组均加入含有N-甲基-D-天冬氨酸300μmol／L、甘氨酸5μmoL／L的培养液，作用10min后更换培养液，N-甲基-D-天冬氨酸的作用时间是10min。N-甲基-D-天冬氨酸处理时加SITS组、N-甲基-D-、天冬氨酸处理后再加SITS组分别于N-甲基-D-天冬氨酸作用时及作用10min后使用氯通道阻断剂SITS，SITS的作用终浓度是0．5mmol／L，作用时间18h。正常对照组神经元用DMEM／F12培养基换液。18h后进行Hoechst荧光染色和MTT实验，定量检测神经元凋亡数目和神经元存活率的变化。并对SITS抗凋亡的浓度效应（0-1000μmol／L）作以观察。结果：①SITS抗N-甲基-D-天冬氨酸作用的浓度效应：SITS浓度低于100μmol/L时，保护作用不明显，当浓度达到250、500、1000μmol／L时具有明显保护作用（P〈0．05）。②神经元细胞核形态的观察：经Hoechst33258染色后，正常神经元的细胞核呈卵圆形，荧光显微镜下呈现均匀的淡蓝色荧光，凋亡的细胞皱缩变圆、染色质浓集或断裂或出现凋亡小体，呈强亮的蓝色荧光，凋亡计数显示，N-甲基-D-天冬氨酸可诱导31．44％左右神经元凋亡，与正常对照组相比差异有显著性（P〈0．05），在N-甲基-D-天冬氨酸作用细胞的同时使用SITS，细胞的凋亡数目减少为19．23％，N-甲基-D-天冬氨酸作用10min后再使用SITS，细胞的凋亡数目升高为31．64％，两组相比差异有显著性（P〈0．05）。③SITS在对N-甲基-D-天冬氨酸处理神经元前后神经元存活率的影响：N-甲基-D-天冬氨酸处理后的细胞存活率明显下降，在N-甲基-D-天冬氨酸作用细胞的同时使用SITS，细胞存活率为93．44％，与对照组相比差异有显著性（P〈0．05）；N-甲基-D-天冬氨酸作用10min后再使用SITS，细胞存活率为73．95％，与N-甲基-D-天冬氨酸处理时加s1TS组相比差异有显著性（P〈0．05）。结论：SITS作为氯通道阻断剂能抑制N-甲基-D-天冬氨酸诱导的神经元凋亡，对N-甲基-D-天冬氨酸诱导的海马神经元死亡有保护作用，且在N-甲基-D-天冬氨酸处理神经元前后使用作用效果不同，作用机制可能与N-甲基-D-天冬氨酸的效应和氯通道活动均被阻断有关。

Protective effects of chloride channel blocker on hippocampal neuronal apoptosis induced by N-methyl-D-aspartate cultured in vitro