大鼠IL-6基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与C/EBP β结合位点的鉴定

目的:构建大鼠IL-6基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒并予鉴定,观察人胚肾细胞(HEK293)中过表达CCAAT/增强子结合蛋白 β(CCAAT/enhancer binding protein β,C/EBP β)对该质粒基因启动子活性的影响?同时,筛选C/EBP β与IL-6基因启动子区的结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠IL-6基因启动子全长序列(-1 791~ +30 nt),将IL-6基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中?将IL-6基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-IL-6-1)和大鼠野生型C/EBP β表达质粒(pIRES2-EGFP-C/EBP β)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定C/EBP β对IL-6基因的启动作用?另用生物信息学软件预测IL-6基因启动子上C/EBP β潜在的结合位点,并构建IL-6基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即pGL3-IL-6-2~5)?将上述IL-6基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和C/EBP β过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选出C/EBP β的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-IL-6-1和pIRES2-EGFP-C/EBP β共转染HEK293细胞发现,IL-6基因启动子活性显著增加?另将pGL3-IL-6-1?pGL3-IL-6-2~5和pIRES2-EGFP-C/EBP β共转染HEK293细胞后发现,pGL3-IL-6-5的启动活性显著低于其他组?提示C/EBP β可能结合在IL-6基因启动子的-618 bp~ -126 bp区域?结论:成功构建了大鼠IL-6基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出了C/EBP β在IL-6基因启动子上的结合部位?