人XPD基因转染对人肝癌细胞的生物学影响

目的：XPD基因作为TFIIH因子中一员，在基因修复中发挥重大作用。本实验构建带有绿色荧光蛋白表达人野生型XPD基因重组质粒pEGFP-N2-XPD，并将其稳定转染至人肝癌细胞株Hep3B细胞，探讨XPD基因与HBx，Cdk7的相互作用，以及细胞周期和凋亡机制。方法：从人宫颈鳞癌上皮细胞株HeLa细胞克隆出人全长XPDcDNA，构建了pEGFP-N2-XPD重组体质粒，并将其稳定转染入Hep3B并筛选单克隆稳定转染重组质粒Hep3B细胞（Hep3B-pEGFP-N2/XPD）和稳定转染空载质粒Hep3B细胞（Hep3B-pEGFP-N2）。利用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白表达，检测转染XPD基因后细胞内XPD，HBx，cdk7的表达量变化，并检测细胞的增殖凋亡以及细胞周期变化。结果：（1）利用酶切和基因测序，成功构建了带有绿色荧光蛋白表达人野生型XPD基因重组质粒pEGFP-N2-XPD。（2）免疫荧光显微镜下，Hep3B-pEGFP-N2和Hep3B-pEGFP-N2-XPD细胞中可观察到绿色荧光蛋白表达。（3）RT-PCR检测：Hep3B-pEGFP-N2/XPD细胞与Hep3B和Hep3B-pEGFP-N2，两对照组相比，HBxmRNA表达明显降低（P〈0．001）XPDmRNA表达明显增高（P〈0．01）Cdk7mRNA表达明显降低（P〈0．001）。（4）MTT检测示Hep3B-pEGFP-N2/XPD与两对照相比，细胞增殖率减弱（P〈0．05）。TUNEL检测示Hep3B-pEGFP-N2/XPD与两对照组比较，细胞凋亡明显增加（P〈0．01）。流式细胞仪检测示Hep3B-pEGFP-N2/XPD进入S期出现障碍，停滞在Go＋G1期的细胞增多，细胞凋亡率逐渐增加。（5）Westernblot检测Hep3B-pEGFP-N2/XPD细胞中XPD蛋白相对表达量均比两对照组高，Cdk7蛋白相对表达量均比两对照组低，差异有统计学意义（P〈0．001）．结论：野生型XPD基因片段成功插入pEGFP-N2空载质粒中，将其稳定转染进人肝癌细胞株Hep3B细胞中，可以在转录和蛋白水平提高细胞XPD表达、降低细胞内HBxCdk7表达。野生型XPD基因过渡表达可能抑制HBxCdk7表达来改变细胞周期、抑制细胞生长、促使细胞凋亡。