双分离法记录Wistar大鼠神经元的全细胞电流

背景：细胞培养与通道电流记录是全细胞膜片钳实验的主要难点。 目的：介绍一种简单可行的降低全细胞膜片钳实验方法，将细胞急性分离与电流的分离技术结合起来，以提高工作效率，缩短实验的时间，从根本上降低膜片钳实验的难度。 方法：SPF级出生4~7 d的wistar大鼠40只，雌雄不限。采用改良的急性分离的方法制备Wistar大鼠脑皮质细胞，将大鼠脑皮质切成400~600 μm厚度的薄片，在人工脑脊液中通混合气静止1 h，并通以氧气。将脑组织块放入含有16 u/mL( type X )和2 u/mL(type XIV) 蛋白水解酶的人工脑脊液中，孵育60 min，清除消化酶。在全细胞电压钳制模式下，保持电位 -80 mV，给予-60 mV到60 mV的去极化脉冲刺激，步阶为+10 mV，刺激波宽160 ms。记录到跨膜总电流，在全细胞电极液里面加入70 mmol/LCsCl，70 mmol/L CsF；在外液中先后加入11 μmol/L 阻断剂河豚毒素、30 mmol/L的氯化四乙胺、1 mmol/L的4-AP。分别记录内向钠电流，瞬时外向钾电流和延迟整流钾电流，结果用clampfit分析处理。主要观察：①细胞的形态学观察。②全细胞电流的记录。③内向钠电流的记录。④外向钾电流的记录。 结果与结论：细胞空间立体结构强，表面光滑，有完整的树突或者轴突，且细胞的活性可以在25 ℃室温下维持8~10 h。在外液中加入1 μmol/L的河豚毒素基本上可以阻断钠电流；30 mmol/L的氯化四乙胺和1 mmol/L的4-AP可以阻断外向钾电流。结果表明，改良的细胞急性分离方法细胞功能完好。通过电流分离技术，不改变细胞外液和电极液，仅需添加特异阻断剂，可记录到内向钠电流，瞬时外向钾电流以及延迟整流钾电流，较之传统方法可显著提高工作效率。

Dual-dissociation method to record whole-cell current of wistar rat neurons