| 摘 要： | 背景:前期实验中采用新型基因沉默方法——抗基因RNA下调了细胞内β-arrestin 2基因的表达,实现细胞水平的基因敲除效应。目的:在前期实验基础上,观察抗基因RNA下调小鼠C17.2神经干细胞β-arrestin 2基因表达后其对DAMGO诱导μ阿片受体脱敏感化的影响。方法:小鼠C17.2神经干细胞应用含体积分数为10%胎牛血清、10mg/L青霉素和10mg/L氨苄青霉素的DMEM培养基,置于37℃,体积分数为5%CO2培养箱进行培养。待细胞长至80%汇合,用0.25%胰蛋白酶消化传代,每五六天传代1次。通过RT-PCR和免疫细胞化学法检测C17.2细胞μ阿片受体的表达。在脂质体介导下,将已被证实具有基因沉默效应的抗基因RNA片段转染C17.2细胞,荧光显微镜下观察转染24h后绿色荧光蛋白的表达。应用μ阿片受体选择性激动剂DAMGO和35S]GTPγS结合实验检测C17.2细胞μ阿片受体与G蛋白的耦联能力。结果与结论:RT-PCR结果证实C17.2细胞内有μ阿片受体存在,而免疫细胞化学结果显示μ阿片受体主要在细胞膜和细胞浆中表达。荧光显微镜下观察可见转染质粒pGPU6/GFP/Arrb9的C17.2细胞中有绿色荧光蛋白的表达。35S]GTPγS结合实验结果显示:未应用DAMGO进行处理的细胞中,35S]GTPγS结合的刺激比率为(253±17)%;应用DAMGO预先对细胞进行处理后,刺激比率降为(113±14)%(P0.05);而转染β-arrestin 2抗基因RNA的细胞在DAMGO刺激下,35S]GTPγS结合的刺激比率则仍维持在(239±15)%,表明抗基因RNA下调β-arrestin 2的表达,可抑制μ阿片受体脱敏感的产生。
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