| 小鼠脂联素重组腺相关病毒载体的构建 |
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| 引用本文： | 张淼,李芳萍,陈黎红,傅静奕,严励,傅祖植. 小鼠脂联素重组腺相关病毒载体的构建[J]. 中国临床康复, 2006, 10(20): 74-76 |
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| 作者姓名： | 张淼 李芳萍 陈黎红 傅静奕 严励 傅祖植 |
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| 作者单位： | [1]贵阳医学院附属医院内分泌科,贵州省贵阳市550000 [2]中山大学附属第二医院内分泌科,广东省广州市510120 |
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| 摘 要： | 目的：构建脂联素重组腺相关病毒载体，为进一步研究脂联素的功能提供基础。方法：实验于2003年在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心进行。以带有小鼠脂联素基因的质粒peDNA3．0-Ad为模板，聚合酶链反应克隆脂联素基因，并将聚合酶链反应扩增产物定向克隆于pAAV-MCS载体，重组AAV-MCS-Ad质粒经双酶切和测序鉴定。随后采用磷酸钙转染法将pAAV-MCS-Ad、pAAV-RC，pAAV-Helper质粒共转染AAV-293细胞，包装得到重组腺相关病毒（rAAV-Ad）。回收病毒原液，采用PEG8000和氯仿纯化浓缩病毒。SDS-PAGE及透射电镜鉴定纯化的病毒，并采用Southern blot测定重组腺相关病毒的滴度。Western blotting检测rAAV-Ad转染H4IIE细胞后脂联素蛋白的表达。结果：①重组质粒AAV-MCS-Ad经双酶切和测序鉴定证实将脂联素基因已正确插入。②SDS-PAGE和电镜均证实rAAV-Ad病毒已构建成功。③Southern blotting测定病毒滴度约为约2．5&;#215;10^14L^-1，通过rAAV-LacZ转染细胞后X-gal染色计数，病毒的感染滴度在（0．83～1．2）&;#215;10^10转导单位／mL。（少Western blotting证实rAAV-Ad转染H4IIE细胞后在30ku处见特异的阳性蛋白条带，证明能有效表达脂联素蛋白。结论：成功构建了携带小鼠脂联素基因的rAAV-Ad载体，经纯化浓缩后具有较好的纯度和较高滴度，能有效转染H4IIE细胞，并表达脂联素蛋白，具有良好的功能，为进一步研究其茁真核细胞中的功能奠定了基础。
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| 关 键 词： | 遗传载体 腺病毒科／＊遗传学 逆转录聚合酶链反应 |
| 收稿时间： | 2006-01-26 |
| 修稿时间： | 2006-02-19 |
Construction of recombinant adiponectin adeno-associated virus vectors |
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