小鼠髓核细胞体外衰老模型的建立及评价

【摘要】 目的：建立并评价小鼠髓核细胞（nucleus pulposus cells,NPCs）体外衰老模型。方法：取8周龄C57BL/6雄性小鼠,体外分离培养小鼠NPCs,并采用细胞免疫荧光（immunofluorescence,IF）检测NPCs标志蛋白聚集蛋白聚糖（aggrecan）的表达进行细胞鉴定。取不同浓度（0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L）的叔丁基过氧化氢（tert-Butyl hydroperoxide,TBHP）干预NPCs,采用CCK8法检测干预2h、4h后的细胞活性,筛选TBHP的最佳干预浓度及时间。应用最佳干预浓度TBHP、最佳干预时间干预P1代NPCs后换成完全培养基继续培养24h、48h、72h,采用衰老相关β半乳糖苷酶染色（senescence-associated β-galactosidase staining,SA-β-gal）检测各时间点的衰老NPCs阳性率,观察不同时间点NPCs的衰老变化。将P2代NPCs分为对照组和模型组,对照组在完全培养基中培养,模型组加入最佳干预浓度TBHP干预最佳时间干预后换成完全培养基培养,采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测两组细胞衰老相关基因p53、p21、p16以及Aggrecan、Ⅱ型胶原蛋白（collagen Ⅱ）、含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5,ADAMTS-5）、基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3,MMP-3）、基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13,MMP-13）mRNA表达,免疫印迹法（Western blot,WB）检测Aggrecan、Collagen Ⅱ、MMP-3、MMP-13、p53、p21蛋白表达水平。结果：分离培养的细胞高表达Aggrecan,为NPCs。TBHP最佳干预浓度为100μmol/L,最佳干预时间为4h。在100μmol/L TBHP干预4h后培养24h、48h、72h,NPCs的SA-β-gal染色阳性率均显著性增加（P＜0.05）,三个时间点间无统计学差异（P＞0.05）,后续模型组加入最佳干预浓度TBHP干预最佳时间干预后换成完全培养基培养24h,对照组培养相同时间。RT-qPCR检测模型组p53、p21、p16、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5 mRNA表达较对照组显著性升高（P＜0.05）,Aggrecan、Collagen Ⅱ mRNA表达较对照组显著性降低（P＜0.05）;WB检测模型组MMP-3、MMP-13、p53、p21蛋白表达较对照组显著性升高（P＜0.05）,Aggrecan、Collagen Ⅱ蛋白表达较对照组显著性降低（P＜0.05）。结论：采用TBHP诱导能成功构建小鼠NPCs体外衰老模型,可为椎间盘退行性变的发病机制研究提供良好的研究样本。

Establishment and evaluation of an in vitro senescence model of mouse nucleus pulposus cells