| 铜绿假单胞菌外毒素A的表达、纯化与生物学活性研究 |
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| 引用本文： | 胡晓梅,胡福泉,申晓冬,黄建军,饶贤才,丛延广,李明,周莹冰,但芸婕.铜绿假单胞菌外毒素A的表达、纯化与生物学活性研究[J].中华微生物学和免疫学杂志,2007,27(3):229-233. |
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| 作者姓名： | 胡晓梅 胡福泉 申晓冬 黄建军 饶贤才 丛延广 李明 周莹冰 但芸婕 |
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| 作者单位： | 400038,重庆,第三军医大学基础部微生物学教研室 |
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| 基金项目： | 全军医学科研十五计划青年基金课题(01Q108)，国家自然科学基金(30572158)，重庆市自然科学基金(CSTC-2005BB5294) |
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| 摘 要： | 目的利用基因工程技术制备铜绿假单胞菌外毒素A(PE),为深入研究PE的致病机理和免疫防治奠定基础。方法应用PCR技术从铜绿假单胞菌基因组中扩增外毒素A全长结构基因,将其克降于原核表达载体pQE-31中,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109, IPTG诱导表达;制备融合蛋白包涵体,并采用Ni-NTA柱亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析分离和纯化目的蛋白;采用透析法对纯化后的目的蛋白进行复性,MTT法测定复性后的重组PE对L929细胞、B16黑素瘤细胞的细胞毒活性。结果通过对PCR反应体系的优化,扩增到了PE全长结构基因。所构建的pQE-PE重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致;转化E.coli JM109后,IPTG诱导目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(M_r)约为66×10~3,与理论预期值一致;破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达。经亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析后蛋白纯度大于95%。MTT法测得重组PE对L929细胞和B16黑素瘤细胞的半数抑制浓度(IC_(50)值)分别为2.13μg/ml、2.58μg/ml。结论通过对PE的表达纯化,获得了具有细胞毒活性的重组PE,为利用基因工程手段大量制备PE的工作奠定了基础。
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| 关 键 词： | 铜绿假单胞菌 外毒素A 克隆表达 蛋白纯化 细胞毒活性 |
Expression, purification of recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A and its cytotoxicity determination |
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| HU Xiao-mei,HU Fu-quan,SHEN Xiao-dong,HUANG Jian-jun,RAO Xian-cai,CONG Yan-guang,LI Ming,ZHOU Ying-bing,DAN Yun-jie.Expression, purification of recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A and its cytotoxicity determination[J].Chinese Journal of Microbiology and Immunology,2007,27(3):229-233. |
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| Authors: | HU Xiao-mei HU Fu-quan SHEN Xiao-dong HUANG Jian-jun RAO Xian-cai CONG Yan-guang LI Ming ZHOU Ying-bing DAN Yun-jie |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Clone expression Protein purification Cytotoxicity |
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